Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Подробный отчет с иллюстрациями представлен в PDF файле приложения. Состояние функциональной разгрузки скелетных мышц наблюдается при иммобилизации в травматологии, у больных, находящихся на длительном постельном режиме, при спинальных травмах и опорно-двигательных нарушениях. Данное состояние приводит, помимо прочих эффектов, к разрушению и дестабилизации цитоскелета мышц. Миопатия критических состояний (CIM) является следствием современного лечения в анестезиологии и интенсивной терапии, включая фармакологические вмешательства и применение устройств, поддерживающих жизнь пациента. Условия CIM создают уникальную ситуацию, когда наблюдается полная потеря механических раздражителей в скелетных мышцах, т. е. потеря внешнего напряжения, которое определяется весом тела, и внутреннего напряжения, которое зависит от мышечных сокращений (Rebeca C. Kalamgi and Lars Larsson; 2016). Поражение мышц у реанимационного больного по своей природе неспецифично и является следствием нескольких процессов: адаптивная реакция на тяжелое повреждение организма, очаговое или тотальное повреждение ЦНС, повреждение спинномозговых нервов, нервно-мышечных синапсов, повреждение мышц, неспецифическое действие лекарственных препаратов. По этой причине, понимание молекулярных механизмов, регулирующих состояние скелетных мышц важно для разработки эффективных реабилитационных программ и возможных фармакологических вмешательства, которые могут предотвратить или облегчить потерю массы и функции скелетных мышц у пациентов с хроническим нарушением сознания (ХНС). Целью данного Проекта является исследование влияния миопатии критических состояний на цитоскелет и механотрансдукцию скелетной мышцы. Для достижения этой цели в первый год реализации Проекта мы провели детальный анализ большого числа цитоскелетных белков и белков внеклеточного матрикса у пациентов с хроническим нарушением сознания, которое и приводит к такой миопатии. Инцизионные мышечные биопсии из камбаловидной мышцы были взяты у 8 пациентов, проходящих лечение в отделении анестезиологии и реанимации РНХИ им. проф. А.Л. Поленова. Оценка степени выраженности парезов (снижение силы мышц) у пациентов с ХНС является трудной задачей в виду отсутствия или выраженного снижения объема и спектра целенаправленных реакций, выполнения команд. У всех пациентов, включенных в исследование, отмечался глубокий тетрапарез преимущественно носивший диффузный характер, латерализация парезов выявлена у двоих пациентов в обоих случаях этиологическим фактором ХНС являлась черепно-мозговая травма. Изменения мышечного тонуса у пациентов с ХНС в основном представлены спастикой с несколькими, наиболее распространенными паттернам. Мышечные биоптаты, взятые у пациентов, замораживались в жидком азоте сразу после взятия. Содержание белков цитоскелета было проанализировано с помощью вестерн-блоттинга, ПЦР в реальном времени и гистохимического анализа. Дополнительно к основному изучению миопатии критических состояний был проведен с эксперимент с антиортостатическим вывешиванием грызунов, для определения изменений ключевых белков цитоскелета в модели разгрузки, при которой остается мышечная активность. Морфологическое исследование камбаловидных мышц у пациентов с ХНС показало колоссальную атрофию мышечных волокон и замещение их объема соединительной тканью. Мы наблюдали снижение площади поперечного сечения мышечных волокон на 73%, экспрессию эмбриональных миозинов, указывающая на денервацию, нарушение структуры цитоскелетных белков, фиброз, отложение липидов и снижение запасов гликогена, которые могут оказать негативное влияние на качество жизни больного, а также существенно осложнить этап реабилитации. Дальнейшее изучение цитоскелета с помощью ПЦР и вестерн-блоттинга помимо очевидного подтверждения атрофических изменений показало сдвиг миозинового фенотипа в сторону «быстрых» (гликолитических) мышечных волокон. Об этом свидетельствует как смена экспрессии самих тяжелых цепей миозина, так и вспомогательных структурных белков актининов, талина, тропомиозина. Разрастание же внеклеточного матрикса, по нашим данным, идет за счет повышения экспрессии коллагена 1а и коллагена 6а. По итогам первого года выполнения Проекта мы впервые выявили особые изменения скелетных мышц, которые развиваются в условиях CIM. Считается, что эти изменения могут зависеть от многих факторов, например от синдрома системного воспалительного ответа и сепсиса. Однако, использование животных моделей с искусственной вентиляцией легких позволило исключить влияние этих системных факторов на скелетные мышцы, при сохранении схожих атрофических изменений (Rebeca C. Kalamgi and Lars Larsson; 2016). Кроме того, было также показано, что сепсис сам по себе не приводит к развитию мышечного фенотипа при CIM (Friedrich et al., 2015). Значит, существует необходимость определения пусковых механизмов, от которых зависит специфичная для ХНС атрофия. Выяснению этого вопроса мы планируем посвятить второй год данного Проекта, в ходе которого будут изучены различные гипотетические механосенсоры и связанные с ними сигнальные пути регулирующие протеостаз скелетных мышц.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Хронические нарушения сознания (ХНС) – это состояния, развивающиеся после комы в сроки, как правило, >28 дней после повреждения головного мозга (Bernat, J. L. 2006), сопровождающиеся восстановлением бодрствования без проявлений осознанной деятельности. Выделяют основные формы ХНС - вегетативное состояние / синдром ареактивного бодрствования (ВС/САБ) и состояние минимального сознания (СМС) (Пирадов, Супонева et al. 2020). Миопатия критических состояний (critical illness myopathy, CIM) возникает у части пациентов, длительно находящихся в критическом состоянии и проявляется выраженной слабостью скелетных мышц, потерей миозиновых волокон, разрушением цитоскелета мышечных клеток, присутствием некроза, пониженной возбудимость мышечной мембраны, нарушением мышечного метаболизма, повышенным распадом белка и снижением синтеза белка, дисфункцией митохондрий. Стоит отметить, что атрофия, вызванная критическим заболеванием, значительно отличается от атрофии, вызванной иммобилизацией и механической разгрузкой (Zink, Kollmar et al. 2009). В первый год работы по данному проекту, проанализированы изменения в содержании основных компонентов цитоскелета камбаловидной мышцы пациентов с хроническим нарушением сознания и миопатией. Исходя из полученных тогда данных, второй год проекта был посвящен изучению сигнальных путей, регулирующих синтез и распад белка в условиях миопатии критических состояний. В первую очередь были изучены маркеры распада белка в камбаловидной мышце. Содержание кальпаина-1 повышалось на 60% в группе CI на уровне белка, и не изменялось на уровне мРНК. В группе CI наблюдалось достоверное снижение ингибирующего фосфорилирования GSK3-β на 32% (Ser9), которое осуществляется протеинкиназой B (AKT). Активность AKT, в свою очередь определяется ее фосфорилированием по сайту Ser473, и в данной работе отмечалась тенденция к его снижению. Изучение экспрессии убиквитинлигазы Trim32 показало достоверное увеличение его мРНК на 155% в группе CI. При этом экспрессия Atrogin1 и MuRF1 наоборот достоверно снизилась на 70% и 78% соответственно. В нашем исследовании сниженная экспрессия этих убиквитин-лигаз подтверждалась повышенным на 250% фосфорилированием FOXO3a. Вместе с тем, в уровне экспрессии LC3b в камбаловидных мышцах пациентов с CIM по сравнению с контролем выявлено не было. Однако, было зафиксировано достоверное повышение уровня фосфорилирования на 170% ULK1 в группе CI по сравнению с контролем, при отсутствии повышения уровня экспрессии мРНК ULK1. Далее было проверено как синтез белка влияет на атрофию в условиях критических состояний. В группе CI наблюдалась тенденция к росту содержания тотального IRS-1, наряду с тенденцией к снижению уровня фосфорилирования AKT. В группе CI фосфорилирование GSK3β было достоверно снижено на 32%. В группе CI наблюдался достоверный рост фосфорилирования как p70 (p70S6K), так и 4E-BP1 на 220% и 51% соответственно. При этом, отмечалась тенденция к снижению фосфорилирования rpS6 на 38%. Изменений в уровне экспрессии ни eEF2, ни его киназы eEF2k не наблюдалось. В группе CI зарегистрирован достоверный рост на 527% экспрессии транскрипционного фактора c-myc, при отсутствии отличий в содержании 45s пре-РНК, также как изменений в содержании 18- и 28-S рРНК по сравнению с группой контроля. В группе CI выявлен достоверный рост экспрессии мРНК IL6 на 320%, при отсутствии роста содержания мРНК рецептора IL6. Для изучения возможных путей запуска сигнальных механизмов синтеза белка было проведено изучение нескольких механосенсоров мышечных волокон. Механотрансдукция, или способность преобразовывать физические силы в биохимические события, особенно важна для мышечных клеток и волокон, которые выполняют преимущественно механические функции. Волокна скелетных мышц оборудованы механосенсорными структурами, которые напрямую участвуют в восприятии различных механических сил и запуске внутриклеточных сигнальных событий, регулирующих метаболические процессы, включая синтез белка. В группе CI было зафиксировано достоверное увеличение фосфорилирования FAK на 50% относительно контрольной группы. Мы также наблюдали достоверное увеличение фосфорилирования YAP в группе CI на 54%. Дополнительно, отмечено достоверное повышение содержания и экспрессии мРНК Piezo1 на 828% и 39% в группе CI относительно контрольной группы.