КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-25-00612
НазваниеУсиление экспрессии изоформ альфа 2 адренорецептора для противодействия прогипертрофической ангиотензиновой стимуляции H9c2 кардиомиоцитов.
РуководительПименов Олег Ювенальевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, Московская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2023 г. |
Конкурс№64 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина
Ключевые словаГипертрофия сердца, антгиотензин, адренергические рецепторы, внутриклеточная сигнализация, экспрессия генов, Са2+ гомеостаз, H9c2 кардимиоциты
Код ГРНТИ76.29.30
СтатусЗакрыт досрочно
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Хроническая симпатоадреналовая и ангиотензинергическая стимуляция сердечной мышцы является одной из основных причин возникновения и патологической гипертрофии сердца и развития сердечной недостаточности (СН). Несмотря на достигнутые успехи в лечении сердечной кардиомиопатии и сердечной недостаточности ежегодный показатель смертности от данных заболеваний составляет более 20%, что требует поиска новых более совершенных терапевтических стратегий. Наши предыдущие исследования выявили в вентрикулярных кардиомиоцитах экспрессию трёх изоформ (α2А, α2B и α2C) α2-адренергических рецепторов (α2-AR), активация которых противодействует адрено- и ангиотензинергическому миокардиальным ответам. Эта, ранее неизвестная кардиопротекторная функция α2-AR может составить основу для будущих терапевтических подходов, препятствующих развитию патологии сердечной мышцы. Однако широкое распространение α2-AR в различных тканях организма при относительно низкой экспрессии этих рецепторов в миокардиальной ткани является существенным препятствием для использования фармакологических активаторов α2-AR для противодействия развитию сердечной дисфункции. Более того в условиях перегрузки миокарда объёмом или давлением наблюдается десенситизация адренергических, и в том числе α2, адренорецепторов, что ещё больше снижает фармакологический потенциал их агонистов. Развитие же альтернативных генно-терапевтических методов, требует более полного понимания вклада отдельных изоформ рецептора во внутриклеточные сигнальные каскады, а также разработки векторов для доставки и экспрессии необходимых изоформ в миокардиальные клетки.
Мы полагаем, что тканеспецифическая активация α2-AR или усиление/коррекция их функции в кардиомиоцитах могут быть использованы для разработки комплементарных имеющимся или альтернативных методов борьбы с развитием сердечной патологии. Такой подход соответствует современному взгляду на то, что усовершенствование терапии СН требует смены парадигмы борьбы с вторичными последствиями болезни (такими как нейрогормональная активация, нарушение гемодинамики, аритмия, ренальная дисфункция и пр.) на непосредственное улучшение структуры и функции сердечной мышц. В рамках данного проекта мы планируем решить следующие задачи:
(1) разработать векторы доставки и экспрессии α2А, α2B и α2C изоформ в культуру H9c2 миобластов - модель кардиомиоцитов;
(2) В условиях прогипертрофической стимуляции H9c2 клеток ангиотензином (AngII) оценить эффективность каждой из изоформ α2-AR при активации агонистом:
- в регулировании внутриклеточного Са2+
- в контроле экспрессии маркеров гипертрофии
Ожидаемые результаты
Запланированные исследования предполагается проводить на клеточной линии крысиных вентрикулярных миобластов H9c2, широко используемых как модель сердечных кардиомиоцитов вследствие их биохимических, морфологических, а также электро-гормональных свойств регуляции. Известно, что H9c2 клетки имеют ангиотензиновый рецептор и являются установленной моделью гипертрофии кардиомиоцитов. С другой стороны, нами была показана возможность агониста α2-AR снижать AngII-зависимую экспрессию маркеров гипертрофии сердца, что является основанием целей данного проекта.
Мы ожидаем, что активация экспрессированных изоформ альфа2-адренорецепторов с разной или равной эффективностью будут уменьшать, вызванную AngII Са2+ нагрузку H9c2 клеток и препятствовать экспрессии генов-маркеров гипертрофии. В частности, мы ожидаем, что агонист альфа2-адренорецепторов будет препятствовать или реверсировать увеличение входа Са2+ через Са2+ каналы L-типа, вызванное AngII. Предполагаемое противодействие α2-адренорецепторов AngII - Gq сигналитзации также должно выражаться в уменьшении внутриклеточной концентрации Са2+, которая будет измерена по флуоресценции Са2+ красителя.
Увеличение экспрессии натрийуретических пептидов ANP и BNP, обычно секретируемых кардиомиоцитами в ответ на перегрузку сердца объёмом, будет рассматриваться как показатель гипертрофической реакции H9c2 клеток. Соответственно, усиление альфа2-адренорецепторного сигнала должно препятствовать появлению данных маркеров гипертрофии.
Известно, что Ang II, активируя преимущественно Ca2+-независимые протеин киназы (PKC), напр. PKCε, через фосфориляцию инициирует семейство митоген-активированных протеинкиназ (MAPK/ERK, P38 и др.), реализующих транскрипционную программу морфологических преобразований кардиомиоцитов, ведущих к гипертрофии сердца. Следовательно, мы ожидаем, что способность α2-Gi сигнализации противодействовать AngII – Gq сигнальному пути будет способствовать уменьшению доли фосфорилированной ERK, препятствуя гипертрофии H9с2 клеток.
Гистоновая диацетилаза II-го типа HDAC 5 имеет антигипертрофическое действие. HDAC II-го класса, включающий в себя характерную для сердечной ткани HDAC5, взаимодействуют с MEF2 (myocyte enhancer factor 2 – фактор увеличения миоцитов 2) и подавляют программу гипертрофической перестройки. В условиях стресса специфические Са2+-зависимые киназы фосфорилируют HDAC II-го класса, что приводит к экспорту этих диацетилаз из ядра, нарушая контроль MEF2-зависимой транскрипционной программы. Мы полагаем, что активация α2-AR, снижающая Са2+ нагрузку и, следовательно, активность кальцинейрина и соответствующих киназ, что может менять долю фосфорилированной формы HDAC5, восстанавливая его способность блокировать активность MEF2. С этой точки зрения α2-AR представляют из себя важный, и возможно уникальный инструмент, поддержания целостности MEF2-HDAC комплексов, блокирующих в кардиомиоцитах реализацию программы гипертрофической перестройки, что может быть использовано в терапевтических целях.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Основной задачей проекта является показать, что усиление альфа2-адренорепторго влияния в клетке способно противодействовать прогипертрофическому эффекту ангиотензиновой стимуляции сердца.
Для решения этой задачи нами были разработаны экспрессионные векторы, содержащие последовательности каждого из подтипов альфа2-адренорецепторов, содержащие последовательность для синтеза красного флуоресцентного белка tagRFP для визуализации успеха трансфекции, а также сайт устойчивости к канамицину для селекции трансфецированных клеток. Была успешно проведена трансфекция адгезивной культуры клеток линии L-929. Однако для дальнейших исследований нами была выбрана линия клеток H9c2, иммортализованные крысиные кардиомиоциты, способные при предъявлении трансформирующего стимула восстанавливать морфологию и функцию рабочего миокарда. Нам удалось инициировать и провести начальную дифференцировку клеток линии H9c2. Показано изменение морфологии, более свойственное для кардиоцитов. Электрофизиологические исследования показали отсутствие электрической активности в исходной культуре клеток во всём диапазоне предъявленных стимулов, однако, в процессе дифференцирования клеток мы наблюдали появление электрической активности и формирования потенциала покоя на уровне -30 mV, по сравнению с недифференцированными (0 mV) клетками.
Методом ОТ-ПЦР в реальном времени был показан низкий уровень экспрессии только альфа2А и 2В рецепторов в нативной культуре H9c2 клеток, альфа2С рецепторы не экспрессируются. На восьмой день дифференцировки культуры мы наблюдали достоверное увеличение экспрессии всех трёх подтипов альфа2-адренорецепторов. Экспрессия таких прогипертрофических факторов как MAPK3 и Clm1 не отличалась в нативных и дифференцированных клетках, а уровень экспрессии Hdac5 достоверно увеличивался. Экспрессию гена тяжёлой цепи миозина Myh6 не наблюдали на данном этапе дифференцировки культуры, также она отсутствует в нативной культуре клеток линии H9c2.
Публикации
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Основной задачей проекта является показать, что усиление альфа2-адренорепторго влияния в клетке способно противодействовать прогипертрофическому эффекту ангиотензиновой стимуляции сердца. Для решения этой задачи нами были разработаны экспрессионные векторы, содержащие последовательности каждого из подтипов альфа2-адренорецепторов, содержащие последовательность для синтеза красного флуоресцентного белка tagRFP для визуализации успеха трансфекции, а также сайт устойчивости к канамицину для селекции трансфецированных клеток. Была проведена успешная трансфекция клеток контрольной линии L929, трансфекция клеток линии Н9с2 проходила на очень низком уровне эффективности. Показано, что в процессе дифференцировки клеточной линии Н9с2, вопреки ожиданию, утрачивается вся электрическая активность. Отсутствует экспрессия всех подтипов α2-AR. Был экспериментально подобран протокол для электропорации клеток с целью увеличения эффективности трансфекции. Однако совмещение внесения экспрессионных векторных конструктов и трансфицирующего агента с электропорацией не дало ожидаемого результата. Анализ уровня экспрессии прогипертрофических факторов показал незначительно увеличение экспрессии Myh6, значительное увеличение экспрессии Hdac5, отсутствие изменения уровня экспрессии MAP3K , но значительное снижение уровня экспрессии Clm1 при культивировании клеток линии Н9с2 в среде содержащей ангиотензин. Интересно, что во всех случаях внесение в среду дексмедетомедина приводило к обращению эффектов ангиотензина на профиль экспрессии перечисленных выше прогипертрофических факторов, кроме его действия уровень экспрессии кальмодулина – наблюдается ещё большее подавление его экспрессии. Неожиданным оказался результат по действию ангиотензина уровень экспрессии α2А- и α2В-AR – мы наблюдали увеличение в 2-3 раза уровня экспрессии этих подтипов рецепторов. Введение дексмедетомедина в культуральную среду приводило к ещё большему увеличению уровня экспрессии этих рецепторов, причём мы наблюдали наиболее выраженное увеличение экспрессии α2А-AR.
Публикации
Возможность практического использования результатов
не указано