Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Углеродные нанотрубки (УНТ) обладают уникальными физико-химическими свойствами, что позволяет использовать их во многих сферах, включая строительство, композитные материалы, наноэлектронику; интенсивно исследуется возможность применения УНТ в биомедицине. Введение новых наноматериалов в промышленность требует понимания влияния этих материалов на окружающую среду и здоровье человека. Основное беспокойство вызывает вопрос генотоксического и канцерогенного действия углеродных нанотрубок. Изучение первичных и вторичных механизмов, потенциально приводящих к генотоксичности и нестабильности генома, имеет решающее значение, так как позволяет получить представление о степени опасности углеродных нанотрубок для здоровья человека. При этом до сих пор отсутствует полное понимание всех возможных молекулярно-клеточных механизмов генотоксичности углеродных наноматериалов, связи их физико-химических характеристик с запуском патологических процессов и дозозависимой реализации повреждающего действия. Разработан способ приготовления суспензий УНТ на основе биосовместимых сред, позволяющий получать агломераты УНТ размером до 1000 нм с содержанием бактериальных эндотоксинов менее 0,25 ЕЭ/мл. Полученные суспензии охарактеризованы с использованием методов просвечивающей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, сканирующей электронной микроскопии, энергодисперсионного рентгеновского микроанализа и динамического светорассеяния. Проведен анализ подходящих культуральных условий для роста сфероидных культур. Для культивирования сфероидов были подобраны 96-луночные планшеты с круглым дном и низкой адгезионной поверхностью (Cell Floater, SPL Lifesciences, Корея). Подходящими условиями для культивирования сфероидов BEAS-2B стали: засевная концентрация – 3000 клеток на 100 мкл культуральной среды DMEM, добавление 40 мкл культуральной среды в лунку на 2-3 день культивирования. Подходящими условиями для культивирования сфероидов HLF стали: засевная концентрация – 1000 клеток на 100 мкл культуральной среды FGM, добавление 30 мкл культуральной среды в лунку на 5 день культивирования. В подобранных засевных концентрациях клетки формируют характерные плотные сфероиды без некротического ядра. Оба способа могут быть применены для культивирования трехмерных клеточных культур в целях анализа взаимодействия вредных веществ с клетками дыхательной системы в остром эксперименте (до 72 часов). Концентрации для изучения цитотоксичности были подобраны с учетом данных о реальных концентрациях УНТ и распределении частиц УНТ по размерам в воздухе рабочей зоны производственных помещений предприятий-производителей, полученных ранее в ходе полевых исследований на предприятиях. В концентрациях, соответствующих производственным экспозициям, воздействие ОУНТ и МУНТ не оказывает цитотоксического действия на культуры клеток дыхательной системы человека. Определен цитотоксический диапазон воздействия УНТ на клетки бронхиального эпителия, значительно превышающий производственные экспозиции (от 25 мкг/мл для очищенных ОУНТ, от 50 мкг/мл для неочищенных ОУНТ и МУНТ). Изображения экспонированных к УНТ клеток, полученные методом темнопольной микроскопии и ПЭМ, позволяют убедиться в проникновении ОУНТ и МУНТ в цитоплазму клеток. Следующим этапом исследования является изучение генотоксичности УНТ при воздействии на клетки дыхательной системы в нецитотоксических и субтоксических концентрациях. При проведении тестов, выявляющих разрывы ДНК (ДНК-комет), используют только нецитотоксические концентрации наноматериалов, так как разрывы ДНК могут быть индуцированы косвенно как следствие цитотоксичности. По результатам теста ДНК-комет показано отсутствие признаков генотоксичности УНТ в концентрациях, соответствующих реальным производственным экспозициям, в отношении клеток дыхательной системы человека. С учетом полученных результатов, необходимо исследовать генотоксическое действие УНТ на субтоксических концентрациях. Выявлена индукция митохондриального внутреннего пути апоптоза одностенными УНТ. Полученные данные позволяют также предположить, что воздействие ОУНТ в цитотоксических концентрациях в течение 72 часов может способствовать запуску патологических процессов в клетках дыхательной системы, которые впоследствии могут привести к началу фиброзных изменений в легочной ткани. Фиброгенная реакция, включающая в себя процессы стимуляции активации фибробластов и трансформации фибробластов в миофибробласты, является распространенным патологическим исходом воспаления, реализуемого при повреждении эпителиальных клеток. При этом накопленные данные подтверждают тесную связь между процессами фиброза и канцерогенеза, из-за чего такой патологический сценарий также может рассматриваться в том числе как механизм, ведущий к нестабильности генома. Дополнительного анализа требуют результаты, демонстрирующие активацию пути формирования инфламмасомы при воздействии МУНТ в низких концентрациях. Также показано, что на токсические свойства УНТ оказывают влияние структурные особенности наноматериалов: размеры, количество слоев, склонность к агломерации, наличие примесей. Очищенные ОУНТ вызывают реализацию цитотоксических эффектов на более низких концентрациях по сравнению с неочищенными ОУНТ, что может быть обусловлено металлическими примесями, вызывающими ригидность структуры и снижающими способность к агломерации. Структурные особенности МУНТ определяют их более активный захват клетками дыхательной системы человека по сравнению с ОУНТ. В ходе проекта далее планируется изучить ряд конечных точек генотоксичности (окислительный стресс, нарушения митотического веретена, профиброгенные эффекты), являющихся проявлениями различных патологических путей, в зависимости от размера, количества слоев, диаметра, наличия включений, длины и механической жесткости УНТ в диапазоне концентраций, включающих известные токсические и нетоксические уровни. Изучение генотоксического действия планируется провести не только на 2D культурах, но и на 3D клеточных моделях, отражающих межклеточные взаимодействия и сохраняющих естественную форму клеток. Полученная информация об условиях реализации механизмов генотоксичности углеродных нанотрубок поможет выявить закономерности, позволяющие оценить степень опасности конкретных углеродных нанотрубок, а также откроет возможность для разработки подходов, снижающих степень проявления генотоксических эффектов.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
За отчетный период, в дополнение к исследованию эпителиальных клеток дыхательной системы человека, были изучены цитотоксические эффекты многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) и очищенных и неочищенных от металлических примесей одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ) в клеточной линии фибробластов легких человека MRC5-SV40. По результатам оценки цитотоксичности УНТ при воздействии на эпителиальные и стромальные клетки дыхательной системы (клетки бронхиального эпителия человека BEAS-2B, клетки альвеолярного эпителия человека A549, фибробласты легких человека MRC5-SV40) установлены конечные точки исследования генотоксичности, равные 0.0006 мкг/мл и 20 мкг/мл. Первая концентрация соответствует референтным уровням воздействия для производственных экспозиций (NIOSH, Bulletin 65, 2013) и не вызывает снижения жизнеспособности клеток более 25% при воздействии УНТ. В качестве второй субтоксической концентрации подобрана такая концентрация, при которой выживаемость клеток составляет не менее 55%. Следующим этапом исследования стало изучение генотоксичности углеродных нанотрубок (УНТ) при воздействии на клетки BEAS-2B, A549, MRC5-SV40 в нецитотоксической и субтоксической концентрациях. Результаты анализа теста ДНК-комет показали отсутствие признаков генотоксичности УНТ в концентрации 0.0006 мкг/мл для всех трех клеточных культур. Однако воздействие УНТ в субтоксической концентрации (20 мкг/мл) приводило к увеличению процентного содержания ДНК в хвосте комет по сравнению с контролем во всех исследованных клетках. Для всех клеточных культур были изучены потенциальные механизмы и последствия генотоксического действия УНТ, среди которых окислительный стресс, прямое повреждение генетического аппарата, профиброгенные и проапоптотические эффекты. Полученные результаты предполагают потенциальный вклад нескольких механизмов в индукцию повреждения ДНК при воздействии трех типов УНТ с разными физико-химическими характеристиками. Для МУНТ характерен ряд механизмов генотоксичности, включая прямое повреждение генетического материала, окислительный стресс и повышенную экспрессию TGFB1. ОУНТ проявляют генотоксичность, сравнимую с МУНТ, обладают большей способностью генерировать АФК независимо от присутствия металлических примесей, неочищенные ОУНТ в высоких концентрациях вызывают усиление экспрессии TGFB1. Однако нам не удалось наблюдать проникновение ОУНТ в ядро клетки. Не выявлено прямой количественной связи между повреждением ДНК или экспрессией TGFB1 (кроме клеточной культуры A549) с уровнем окислительного стресса при воздействии ОУНТ. Данные факты позволяют предположить вовлеченность в реализацию генотоксических эффектов ОУНТ альтернативных механизмов, таких как ферроптоз, активные формы азота, что зависит от физико-химических свойств этого вида наноматериалов и является дальнейшим перспективным направлением исследований. Кроме того, было установлено, что механизмы генотоксичности при экспозиции к УНТ различались в зависимости от вида клеточной культуры: для фибробластов, в отличие от эпителиальных клеток дыхательных путей, не были показаны такие механизмы, как индукция экспрессии профиброгенного фактора и апоптоз. Разработаны протоколы культивирования клеток для получения трех 3D моделей: моноклеточной 3D сфероидной модели клеток бронхиального эпителия BEAS-2B, моноклеточной 3D сфероидной модели фибробластов легких MRC5-SV40 и совместной 3D сфероидной модели клеток бронхиального эпителия и фибробластов легких BEAS-2B+MRC5-SV40. В ходе экспериментов было показано повреждение эпителия различных отделов дыхательных путей при воздействии УНТ, что может способствовать эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) (Kalluri R, 2010). По данным ряда исследователей (Chatterjee N, 2023; Dong, 2019; Pardali, 2017; Polimeni, 2015), ЭМП играет ключевую роль в развитии фиброза и прогрессировании опухолевого роста. Таким образом, в качестве приоритетного направления исследований явилась разработка и исследование новой 3D сокультуры эпителиальных клеток дыхательной системы и фибробластов. Принципы культивирования трехмерных клеточных моделей для оценки токсичности углеродных наноматериалов могут быть использованы для решения других задач с учетом клеток-мишеней и особенностей изучаемых материалов. Сравнение результатов, полученных на 2D и 3D моделях, свидетельствует о том, что традиционные 2D-клеточные модели могут демонстрировать заниженные или завышенные оценки токсичности материалов. Результаты исследования токсичности УНТ на разработанных 3D моделях продемонстрировали отсутствие проапоптотических и профиброгенных эффектов на концентрациях, соответствующих референтному уровню воздействия. Сфероиды клеток BEAS-2B оказались более чувствительными по сравнению с 2D культурами к цитотоксическим и проапоптогенным, но не профиброгенным эффектам УНТ. При этом в 3D-модели фибробластов MRC5-SV40, в отличие от 2D-культуры, были показаны проапоптотические эффекты ОУНТ. Однако результаты, полученные с применением 3D сокультуры клеток бронхиального эпителия BEAS-2B и легочных фибробластов MRC5-SV40, не подтверждают данные, полученные с применением 3D-монокультур в отношении проапоптотических эффектов на низких дозах. Таким образом, 3D сокультура демонстрировала меньшую чувствительность к УНТ по сравнению с 3D монокультурами. Можно предположить, что взаимодействие эпителиальных и стромальных клеток и их обмен сигналами ведет к формированию наиболее приближенного к нативной ткани микроокружения и включения защитных механизмов при воздействии УНТ. 3D клеточные модели могут быть рекомендованы в качестве более объективного скринингового метода для оценки токсичности УНТ при переходе от традиционных экспериментов in vitro к исследованиям in vivo. По результатам исследования подготовлены 4 публикации в рецензируемых журналах, в том числе одна публикация в журнале, входящем в Q1. Получено свидетельство о государственной регистрации базы данных №2023622606 от 28.06.2023 г. «База данных показателей токсичности углеродных нанотрубок российских производителей в клетках дыхательной системы человека». Подана заявка на патент №2023115780/10(033606) от 15.06.2023 «Способ сокультивирования трехмерных клеточных культур нижних дыхательных путей человека для получения клеточной модели для исследований in vitro».