Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения работ предложен новый путь к решению проблемы создания безопасных и эффективных адъювантов для разработки субъединичных вакцин с целью обеспечения надежной профилактики инфекционных заболеваний. Непосредственной целью НИР является разработка низкотоксичного и высоко иммуногенного тубулярного иммуностимулирующего комплексов на основе тритерпеновых гликозидов из голотурии Apostichopus japonicus и гликоглицеролипида моногалактозилдиацилглицерола из морской макроводоросли Ulva lactuca. В настоящее время иммуностимулирующие комплексы рассматриваются как перспективные адъюванты – компоненты субъединичных вакцин, способные значительно усиливать иммунный ответ на вводимые антигены, повышая эффективность вакцинных препаратов. Особенно остро задача по разработке эффективных и безопасных вакцин встала в связи с появлением новых, не известных ранее, опасных высококонтагиозных заболеваний. Применение адъюванта позволяет снижать вводимые дозы антигена, что имеет важное значение в условиях пандемии, когда в короткие сроки необходима крупномасштабная вакцинация населения, а наработка больших количеств антигена не представляется возможной (например, как в случае появления новой коронавирусной инфекции COVID-19 или вируса гриппа). В литературе хорошо известны иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМ/ISCOM), состоящие из суммы тритерпеновых гликозидов квиляйи мыльной Quilaja saponaria Molina (QuilA), холестерина и фосфолипида (фосфатидилхолина или фосфатидилэтаноламина). Такие комплексы принято называть классическими ИСКОМ. Сообщалось, что иммунизация субъединичными белковыми антигенами в составе ИСКОМ позволяет индуцировать реакции как клеточного, так и гуморального иммунитета, направленные против вирусных и бактериальных антигенов (Kersten, Crommelin, 1995, 2000). Такой способ иммунизации в десятки раз усиливает образование специфических антител по сравнению с использованием убитых возбудителей или их субъединичных антигенов (Lovgren, Morein, 1988). Ранее нами была проведена работа по оптимизации состава классических ИСКОМ с целью снижения их токсичности. Состав комплексов был модифицирован путем замены сапонинов QuilA, обладающих высокой гемолитической активностью, на тритереновые гликозиды (ТГ) дальневосточной голотурии Cucumaria japonica, токсичность которых полностью исчезает при добавлении холестерина (Попов 2012). Иммунологически неактивные фосфолипиды в ИСКОМ были заменены нами на гликолипид, полученный из разных видов морских макрофитов Японского моря – моногалактозилдиацилглицерол (МГДГ), который обладает широким спектром биологической активности (Lee et al., 2004). В ходе выполнения этих работ нами был получен иммуностимулирующий комплекс нового типа – тубулярный иммуностимулирующий комплекс (ТИ-комплекс). Данный адъювант, состоящий из трубчатых наночастиц, принципиально отличается по структуре от классических иммуностимулирующих комплексов, частицы которых имеют везикулярную структуру (Sanina et al., 2018). Исследования показали, что введение субъединичного антигена в состав ТИ-комплекса существенно повышает его иммуногенность, усиливая протективность вакцины. Так, например, иммунизация лабораторных мышей рекомбинантным химерным субъединичным антигеном на основе белка Е вируса клещевого энцефалита в составе ТИ-комплекса позволила добиться 80%-ной выживаемости мышей при экспериментальном заражении клещевым энцефалитом (Sanina et al., 2018). Замена ТГ из Cucumaria japonica на ТГ из дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus является актуальной задачей, так как позволит не только дополнительно снизить токсичность комплекса и модифицировать его иммунобиологические свойства, но и существенно удешевить методику его получения за счет замены тяжелых в очистке ТГ из C. japonica на более просто для получаемые ТГ из A. japonicus. Необходимо отметить, что существенным препятствием на пути к практическому применению ТГ из дальневосточного трепанга долгое время являлся большой дефицит сырья. Дальневосточный трепанг занесен в красную книгу, и его промысловый лов долгое время не проводился. В настоящее время в результате развития марикультуры в Приморском крае налажено производство этого ценного продукта. Однако, стоимость сырья остается весьма высокой. Также, до сих пор отсутствуют методы получения высокочистой суммы ТГ из дальневосточного трепанга, пригодные для промышленного внедрения. Такое положение вопроса диктует необходимость разработки эффективной методики получения ТГ из дальневосточного трепанга в рамках реализации данного проекта В результате выполнения данного этапа НИР была оптимизирована процедура заготовка и фиксация сырья для выделения ТГ - дальневосточного трепанга и его внутренностей. Предложена новая методика получения суммы ТГ из A. japonicus. Методами обращенно-фазной хроматографии и адсорбционной хроматографии на силикагеле в индивидуальном состоянии выделены 2 главных ТГ из дальневосточного трепанга. С помощью методов ЯМР и масс-спектрометрии установлены структуры выделенных ТГ. Произведена заготовка сырья для выделения моногалактозилдиацилглицерола (МГДГ) - морской макроводоросли Ulva lactuca и получены общие липидные экстракты по методу Фольча. В ходе выполнения данного этапа НИР была разработана новая высокоэффективная методика препаративного получения МГДГ высокой степени чистоты с использованием жидкостной экстракции и флэш-хроматографии. Проведено исследование состава жирных кислот выделенных препаратов МГДГ, показано что получаемые по предложенной методике препараты МГДГ характеризуются полноценным составом жирных кислот и высокой степенью ненасыщенности. Методом гидратации липидных пленок (Kostetsky et al., 2011) на основе выделенных ТГ и МГДГ были получены препараты ТИ-комплексов, проведено их исследование методом трансмиссионной электронной микроскопии. Установлено, что оптимальным для формирования ТИ-комплекса является молярное соотношение компонентов МГДГ-Хол-ГолА1 2:2:1 Дана морфологическая характеристика структуры наночастиц ТИ-комплекса. В результате выполнения данного этапа проекта получен ТИ-комплекс с молярным соотношением компонентов МГДГ-Хол-ГолА 1:2:2. Этот комплекс будет использован для дальнейших исследований его иммунобиологических свойств, при выполнении второго этапа проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе работ на данном этапе было выполнено: 1. Наработка рекомбинантного химерного антигена, состоящего из части последовательности белка Е (III домен) вируса клещевого энцефалита и порина OmpF Y. pseudotuberculosis проводили в клетках Esherichia coli по опубликованной ранее методике (Stenkova et al., 2017). Чистота полученного химерного рекомбинантного антигена составила 90%, концентрация - 20 мг/мл. 2. На основе ТИ-комплексов с молярным соотношением компонентов МГДГ-Хол-ГолА1 2:2:1 и МГДГ-Хол-ГолВ 2:2:1 и рекомбинантного химерного антигена, состоящего из части последовательности белка Е (III домен) и порина OmpF из Y. pseudotuberculosis были получены вакцинные конструкции против вируса клещевого энцефалита. В результате выполнения работ было установлено, что введенный химерный рекомбинантный антиген эффективно включается в состав ТИ-комплексов. Полнота включения составила около 90% вне зависимости от использованного ТИ-комплекса, количества вводимого антигена и способа введения. При этом ТИ-комплекс на основе голотоксина А1 включает антиген несколько эффективнее, чем комплекс на основе голотоксина В. Полученные данные показывают, что включение химерного рекомбинантного антигена при ультразвуковой обработки суспензии ТИ-комплекса с раствором антигена в течение 1 минуты, при 10% максимальной мощности дезинтегратора (SONOPULS Ultrashall-Homogenizatoren HD 2070) в режиме «7» происходит несколько более активно, чем при интенсивном встряхивание суспензии ТИ-комплекса с раствором белка в течение 1 минуты на орбитальном миксере типа Vortex. Несмотря на то, что обработка ультразвуком приводила к более активному включению химерного рекомбинантного антигена в состав ТИ-комплексов, для дальнейшей работы был выбран вариант с использованием встряхивания на орбитальном миксере. 3. В результате тестирования токсичности полученных ТИ-комплексов in vitro, было установлено, что тритерпеновые гликозиды из голотурии A. japonicus обладают высокой гемолитической активностью, однако в комплексе с холестерином эта активность значительно снижается примерно в 9 раз. По этому параметру тритерпеновые гликозиды из A. japonicus превосходят тритерпеновые гликозиды из C.japonica, для которых в чистом виде ЕD50 составляет около 1 мкг/мл (Kostetsky et al, 2011). Таким образом тритерпеновые гликозиды из A.japonicus проявляют меньшую гемолитическую активность. Также из сравнения с литературными данными следует, что тритерпеновые гликозиды из A.japonicus сильнее снижают свою гемолитическую активность в комплексе с холестерином, чем тритерпеновые гликозиды из C.japonica (Ли и др., 2008). Сравнение полученных нами данных и сведений из литературных источников (Kostetsky et al, 2011) показывает, что гемолитическая активность полученных нами ТИ-комплексов на основе тритерпеновых гликозидов из A. japonicus меньше гемолитической активности аналогичных комплексов на основе тритерпеновых гликозидов из C. japonica, полученных ранее. Также было установлено, что ТИ-комплекс на основе голотоксина В обладает меньшей гемолитической активностью, чем комплекс на основе голотоксина А. 4. В результате определения цитотоксической активности полученных ТИ-комплексов на перитонеальных макрофагах мышей в тесте связывания трипанового синего было установлено, что комплексы холестерина с тритерпеновым гликозидом из A.japonicus обладают невысокой токсичностью в отношении перитонеальных макрофагов мышей. При этом комплексы МГДГ-Хол-ТГ 2:2:1 (до есть с добавлением МГДГ) демонстрируют еще меньшую токсичность и являются малотоксичными. 5.В результате исследования токсичности ТИ-комплексов in vivo было установлено, что ТИ-комплекс МГДГ-Хол-ГолВ 2:2:1 не обладает острой токсичность в дозах до 128 мг/кг веса. Признакихронической токсичности проявлялись только при дозах ТИ-комплекса 64 и 128 мг/кг, тогда как меньшие дозы животными переносятся хорошо. Главным проявлением хронической токсичности ТИ-комплекса было падение массы тела подопытных животных, наблюдаемое в течение 14 дней. Таким образом, полученные данные показывают, что ТИ-комплекс МГДГ-Хол-ГолВ 2:2:1 до дозы 32 мг/кг веса не обладал токсичностью. 6. Исследование иммуномодулирующей активности ТИ-комплексов с помощью теста определения лизосомальной активности макрофагов подопытных мышей с акридиновым оранжевым показало, что максимальная активация перитонеальных макрофагов происходит при дозе ТИ-комплекса МГДГ-Хол-ГолВ 2:2:1 соответствующей 10 мкг голотоксина В на мышь, тогда как у мышей, получивших дозу 50 мкг/мышь, активность макрофагов достоверно не отличалась от интактного контроля и даже имела тенденцию к супрессии. Доза ТИ-комплекса соотвествующая 10 мкг голотоксина В на мышь, намного меньше доз ТИ-комплекса, вызывающих токсический эффект. 7. В результате исследования адъювантной активности ТИ-комплексов МГДГ-Хол-ГолВ 2:2:1 и МГДГ-Хол-ГолА 2:2:1 было установлено, что иммунизация подопытных мышей химерным антигеном на основе последовательности белка Е (III домен) ВКЭ и OmpF порина Y. pseudotuberculosis в чистом виде в дозе 1 мкг/мышь приводит к эффективному образованию специфических антител класса IgG. При этом иммунизация подопытных мышей этим антигеном в той же дозе, но в составе ТИ-комплексов на основе тритерпеновых гликозидов дальневосточной голотурии A. japonicus приводит к повышению уровня образования специфических антител класса IgG в 7 раз. Сравнение адъювантной активности двух исследованных ТИ-комплексов показывает, что комплекс на основе голотоксина А обладает несколько большей активностью, чем комплекс на основе голотоксина В, хотя обнаруженная разница не достоверна. Таким образом, можно считать, что полученные ТИ-комплексы могут быть использованы в качестве эффективных и безопасных адъювантов для разработки субъедининчных вакцин нового поколения, что подтверждает ранее полученные нами результаты (Stenkova et al., 2017).