Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Наше исследование направлено на выявление механизмов действия клинически значимого 25-гидроксихолестерина (25-ГХ) на зависимый от бета-адренорецепторов контроль сократимости и внутриклеточной сигнализации кардиомиоцитов предсердий мышей. 25-ГХ быстро образуется иммунными клетками (макрофагами, дендритными клетками) при воспалении, за счет усиления экспрессии фермента холестерин-25-гидроксилазы, в итоге уровень 25-ГХ в кровотоке и тканях поднимается на порядок. В работе был использован тензометрический подход для оценки силы сокращения предсердий мыши, а также современные методы флуоресцентной микроскопии (в т. ч. конфокальной), позволяющие оценить внутриклеточные уровни кальция, оксида азота, активных форм кислорода, свойства мембран клеток (текучесть, стабильность липидных рафтов, распределение сигнальных липидов), освобождение катехоловых аминов из пресинаптических варикозов. Дополнительно, фармакологические подходы, позволили определить ключевые сигнальные молекулы и пути, через которые реализуются эффекты 25-ГХ в кардиомиоцитах предсердий. При проведении исследования были выявлены эффекты аппликации экзогенного 25-ГХ в предсердиях мышей и расшифрованы основные механизмы. Показана роль бета1,2,3-адренорецепторов в депрессантном эффекте 25-ГХ на инотропную реакцию предсердий. Оценена роль LX рецепторов плазмалеммы и липидных рафтов в этом быстром механизме контроля сокращения. А также с помощью применению нового подхода для визуализации нейропередачи в нейро-кардиальных соединениях предсердий мыши, было показано, что 25-ГХ может усиливать экзоцитоз катехоловых аминов из синаптических варикозов. 1. 25-ГХ сам по себе в концентрациях 0.01-1 мкМ немного повышал амплитуду сокращения предсердий. Однако обработка предсердий 1мкМ 25-ГХ в течении 20 мин существенно угнетала положительную инотропную реакцию предсердий на стимуляцию бета-адренорецепторов изопротеренолом (10-100 нМ), что сопровождалось ослаблением вызванного изопротеренолом увеличения амплитуды Ca2+-транзиента и флуоресценции DAF-FM, отражающей продукцию оксида азота. 2. Было показано, что депрессантное действие 25-ГХ связано с подавлением активности бета-1-адренорецепторов, в то время как инотропный эффект, зависимый от бета-2 адренорецепторов не изменялся под влиянием 25-ГХ. 3. Также показано, что угнетающее действие 25-ГХ на позитивный инотропный эффект стимуляции бета-адренорецепторов предотвращался при ингибировании бета3-адренорецепторов, Gi-белка, бета-гамма димера G белка, а также GRK2 киназы. Следовательно, 25-ГХ может усиливать сигнализацию через путь бета-3-АР / Gi-белок и его бета гамма димер / GRK2 киназа, что способствует опосредованному активацией бета-1-АР усилению амплитуды сокращений, кальциевого транзиента и продукции оксида азота. Этот механизм потенциально может предотвратить избыточную активацию сердца со стороны симпатической системы в условиях воспалительной реакции, сопровождаемой усиленной продукцией 25-ГХ. 4. 25-ГХ может модулировать бета-3-адренорецепторы непрямым путем, а через связывание с белками с высокой аффинностью к 25-ГХ, а частности LX рецепторами. Выяснили, что положительная инотропная реакция предсердий при аппликации 25-ГХ (0,01-10мкМ) и депрессантное действие 25-ГХ в ответ на стимуляцию β-адренорецепторов изопротеренолом в предсердиях мышей, подавлялись селективными модуляторами LX рецепторов (как антагонистом, так и агонистом), а также частичным разрушением липидных рафтов за счет действия метил-β-циклодекстрина в низкой концентрации. Модуляторы LX рецепторов оказывали то же действие, что и 25-ГХ. В совокупности эти данные указывают на существование 25-ГХ-зависимой регуляции предсердной инотропии и на роль LX рецепторов плазмалеммы и липидных рафтов в этом быстром механизме контроля сокращения. 5. Оценка свойств мембран кардиомиоцитов показала, что 25-ГХ изменял свойства мембран кардиомиоцитов в сторону увеличения целостности липидных рафтов и снижения текучести мембран. Стабильность липидных рафтов в кардиомиоцитах может снижаться при сердечной недостаточности и гипертрофии сердца, поэтому мембран-стабилизирующий эффект 25-ГХ может рассматриваться как протективный. 6. Анализ динамики вызванного деполяризацией экзоцитоза лжемедиатора FFN511 из пресинаптических варикозов симпатических нервов после 15 мин аппликации 25-ГХ показал увеличение выброса FFN511 по сравнению с контрольными препаратами, что становилось еще более выраженным на фоне блокирования обратного захвата катехоловых аминов в синаптические везикулы. Таким образом, 25-ГХ может усиливать экзоцитоз везикул, содержащих катехоловые амины, из синаптических варикозов, что в свою очередь может вести к сильной стимуляции адренорецепторов (в том числе бета3-АР) сердца. Полученные данные позволяют взглянуть на 25-ГХ как на кардиотропную сигнальную молекулу, имеющую физиологическую и (или) патофизиологическую роль. В целом, наше исследование нацелено на развитие концепции о регуляторной (модуляторной) роли производных холестерина в регуляции деятельности сердца. Учитывая высокую клиническую важность 25-ГХ, данное исследование помогает расширить представления о путях, обеспечивающих гуморальный контроль деятельности сердца со стороны иммунной системы, а также выявить перспективы использования терапевтических подходов, направленных на коррекцию метаболизма ГХ при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
25-гидроксихолестерин (25ГХ), является мощным регулятором иммунных реакций, его синтез резко увеличивается макрофагами во время воспаления. Мы предполагаем, что 25-гидроксихолестерин может оказывать кардиозащитное действие, ограничивая последствия чрезмерной стимуляции β-адренорецепторов (β-AР), особенно продукцию активных форм кислорода (АФК) в предсердиях мышей. Было показано, что изопротеренол, агонист β-адренорецепторов, повышал вне- и внутриклеточные уровни АФК, а также продукцию АФК митохондриями. Это усиление продукции АФК ингибировалось блокаторами НАДФН-оксидазы, а также 25-гидроксихолестерин в низкой микромолярной концентрации. Ингибирование β3-адренорецепторов (β3-AР), Gi белка и протеинкиназы Cε полностью предотвращало антиоксидантное действие 25-гидроксихолестерина. Кроме того, 25- гидроксихолестерин подавлял индуцированное изопротеренолом перекисное окисление липидов, а также АФК-зависимый компонент положительного инотропного ответа на изопротеренол. Также, 25-гидроксихолестерин снижал выработку митохондриальных АФК и перекисное окисление липидов, индуцированное митохондриальным ядом антимицином А. Таким образом, 25-гидроксихолестерин может служить защитным оксистерином в модели окислительного повреждения сердца. Также были исследованы эффекты активации бета-адренорецепторов при моделировании воспаления за счет введения мышам внутрибрюшинно липополисахарида (ЛПС, 2мг/кг, за 12 часов до эксперимента), контрольные животные получали эквивалентную дозу растворителя. Внутрибрюшинное введение липополисахарида мышам вызывает повышение продукции 25-гидроксихолестерина и провоспалительных цитокинов. Выявили, что у мышей, получавших ЛПС, инотропная реакция предсердий на изопротеренолом и добутамин (селективный агонист бета1-АР) - была значительно снижена, в то время как реакция на фенотерол (селективный агонист бета2-АР) не менялась по сравнению с контрольными мышами. При использовании изопротеренола совместно с антагонистом бета 3-адренорецепторов – SR не было обнаружено достоверных изменений инотропной реакции предсердий у мышей, получавших ЛПС по сравнению с контрольными мышами. Однако, анализ иммуноэкспрессии на мембране адренорецепторов выявил снижение доли бета-1-АР и увеличение доли бета-3-АР после введения ЛПС. В контрольных препаратах происходили аналогичные изменения иммуноэкспрессии адренорецепторов после инкубации с 25-гидроксихолестерином препаратов предсердий ex vivo. Вероятно, в условиях воспаления эндогенный 25-гидроксихолестерин может модулировать изменения бета-адренергической регуляции сходным образом, что и острое воздействие экзогенного 25-гидроксихолестерина. Одним из механизмов подавление положительной инотропной реакции предсердий может быть угнетение бета1-АР и усиление бета-3-АР-сигнализации под влиянием повышения продукции 25- гидроксихолестерина.