Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Рост заболеваемости и низкий уровень пятилетней выживаемости пациентов с раком молочной железы (РМЖ) делает актуальной задачу совершенствования терапии данного заболевания. Современные тенденции в подходах к лечению РМЖ связаны с использованием комбинированной терапии, направленной на ингибирование сразу нескольких путей образования и роста опухолевых клеток. Серьезным ограничением данного подхода является возникновение побочных реакций, зачастую превышающих нежелательные эффекты от каждого отдельного препарата. На сегодняшний момент инкапсулирование веществ в матрицу носителя является эффективным подходом для улучшения профиля безопасности препарата. Снижению нежелательных эффектов также способствует тот факт, что препараты в носителе накапливаются специфично в органе-мишени за счет эффекта повышенной проницаемости и удерживания. Более того, инкапсуляция в носитель позволяет преодолеть химиорезистентность препаратов при проведении химиотерапии. В рамках выполнения данного этапа проекта перед нами была поставлена задача получения наночастиц на основе ПЛГА-ПЭГ с совместным инкапсулированием доксорубицина (DOX) и вориностата (SAHA) для лечения рака молочной железы. В данном проекте впервые было изучено оптимальное соотношение указанных препаратов, при котором будет наблюдаться синергизм в отношении широкой клеточной панели, затрагивающей большую часть подтипов РМЖ: HCC-1954, MCF-7/ADR, SKBR-3, MCF-7 и MDA-MB-231. С помощью математической модели Loewe и метода Чоу-Талалай был выявлен синергетический эффект комбинаций SAHA и DOX в отношении HER2-положительного подтипа опухолевых линий клеток: HCC-1954, MCF-7/ADR и SKBR-3, а также аддитивный эффект в отношении клеточных линий MCF-7 и MDA-MB-231. На основе определенного индекса синергизма были выбраны соотношения SAHA/DOX для каждого типа опухолевых клеток молочной железы, подтвержден их синергетический эффект с помощью метода Чоу-Талалай и рассчитано среднее оптимальное соотношение комбинации SAHA/DOX для всех клеточных моделей - 30:1. Полученная оптимальная комбинация SAHA/DOX продемонстрировала высокую способность к активации программируемой гибели клеток линии HCC-1954, а также повреждению ДНК в опухолевых клетках. Также разработанная комбинация проявила высокую эффективность в отношении сфероидов HER2-положительных клеток SKBR-3 и MDA-MB-453. Корреляция между показателями синергизма и подтипами клеток свидетельствует о перспективности данного подхода для персонализированной терапии онкологических заболеваний. Были получены наночастицы ПЛГА-ПЭГ с совместным инкапсулированием доксорубицина и вориностата, были определены основные характеристики полученных наночастиц: средний диаметр 198 нм, ПДИ 0.151, дзета-потенциал -25 мВ. Была функционализирована поверхность наночастиц с помощью красителя Cy5.5. Разработку и оптимизацию метода получения наночастиц проводили с помощью планов Бокса-Бенкена. Была подтверждена сферическая форма полученных наночастиц с помощью метода просвечивающей электронной микроскопии. Для количественного анализа SAHA и DOX был разработан и валидирован метод ВЭЖХ, позволяющий одновременно анализировать оба соединения в наночастицах с совместным инкапсулированием. Была изучена кинетика высвобождения препаратов из наночастиц, полученный профиль кривых позволит оптимизировать проведение дальнейших экспериментов in vitro и in vivo при изучении эффективности синтезированных наночастиц. Таким образом, все запланированные задачи на первый год проекта были выполнены в полном объеме.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
За отчетный период была исследована цитотоксическая активность полученных наночастиц в отношении 2D клеточных линий рака молочной железы (MCF-7, MCF-7/ADR, SKBR-3, HCC-1954, MDA-MB-231) и 3D (сфероиды) моделей (MCF-7, SKBR-3, MDA-MB-231). Было показано, что DOX-NP оказывали выраженное влияние на пролиферацию опухолевых клеток, в то время как SAHA-NP проявляли наибольшую активность в отношении клеток линий MCF-7/ADR, MDA-MB-231 и SKBR-3. Оценка синергетического, антагонистического и аддитивного эффекта комбинации наночастиц (SAHA-NP и DOX-NP) была определена с помощью метода Чоу-Талалай. Полученные значения логарифмического комбинационного индекса указывали на синергетический эффект комбинации наночастиц в отношении клеток линий SKBR-3 и MDA-MB-231, в самых низких разведениях в отношении клеток MCF-7 и MCF-7/ADR. Было рассчитано среднее соотношение SAHA и DOX в составе наночастиц (30:1, соответственно), способствующее проявлению синергизма полученных наночастиц в отношении всех выбранных клеточных линий. Была показана способность частиц, содержащих DOX и SAHA, в соотношении 1:30, ингибировать рост клеток на 2D (монослой) и 3D (сфероиды) моделях клеток линий MCF-7, SKBR-3 и MDA-MB-231. SAHA-NP были менее эффективны в отношении 3D культур клеток линии MCF-7 по сравнению с 2D моделью. Совместное включение SAHA и DOX в частицы способствовало увеличению цитотоксической активности SAHA в сравнении с моноинкапсуляцией SAHA-NP. Добавление SAHA к DOX способствовало повышению эффективности DOX как в отношении 2D, так и 3D модели жизнеспособности сфероидов. Стоит отметить, что SAHA-NP, DOX-NP и SAHA-DOX-NP обладали высокой эффективностью в отношении 3D культуры клеток SKBR-3, что также согласуется с результатами метода Чоу-Талалай. Таким образом, совместное включение SAHA и DOX в полимерные частицы повышает эффективность препаратов как в отношении 2D, так и 3D культурах клеток HER2-положительного подтипа. Оценка способности разработанной комбинации в составе наночастиц к образованию апоптотических популяций показала, что инкубация клеток SKBR-3 с SAHA-NP приводит к снижению ранних и поздних апоптотических популяций, а также к увеличению количества живых клеток по сравнению с DOX-NP и SAHA-DOX-NP. В свою очередь, SAHA-DOX-NP стимулировали больше апоптотических популяций, чем DOX-NP, что может свидетельствовать о наличии синергетического эффекта комбинации SAHA/DOX в наночастицах, а также указывать на смещение механизма гибели клеток в сторону апоптотического. Исследование интернализации наночастиц, содержащих SAHA и DOX эффективное накопление в клетках SKBR-3 после 24 ч инкубации. Определение гемолитической активности наночастиц показало их гемосовместимость и возможность для безопасного внутривенного введения. Исследование острой токсичности показало низкую токсичность полученных наночастиц (более 2 г/кг). Противоопухолевая эффективность была исследована в отношении модели аденокарциномы молочной железы человека линии MDA-MB-231, привитой иммунодефицитным мышам линии BALB/с nude. DOX-SAHA-NP проявили наиболее выраженную противоопухолевую эффективность – объем опухоли значимо отличались от контрольной группы на 26, 29 и 33 день, а также значимо отличались от группы, получавшей смесь субстанций на 33 день (p<0,05). Биораспределение DOX-SAHA-Cy5.5-NP исследовали на мышах линии BALB/с nude, с привитой аденокарциномой молочной железы человека линии MDA-MB-231. Наиболее выраженное накопление наблюдалось в селезенке, печени и опухолевой ткани. Таким образом, полученные наночастицы проявляли высокую эффективность действия, низкую неспецифическую токсичность и селективное накопление в опухолевой ткани. Все запланированные задачи на второй год проекта были выполнены в полном объеме.