КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-24-01109

НазваниеВизуализация и картирование эпигенетических модификаций гистонов с помощью генетически кодируемых зондов со свойством светоиндуцируемой димеризации

РуководительПутляева Лидия Викторовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2022 г. - 2023 г. 

Конкурс№64 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаэпигенетические модификации гистонов, хроматин, флуоресцентный белок, генетически кодируемый сенсор, флуоресцентная микроскопия живых клеток, светоиндуцированная димеризация белков

Код ГРНТИ34.05.00

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Эпигенетические модификации хроматина играют огромную роль в регуляции экспрессии генов. Особое место в этом занимают посттрансляционные модификации гистонов - метилирование, ацетилирование, фосфорилирование и др., которые могут происходить по различным аминокислотным положениям. Комбинации модификаций гистонов, так называемый гистоновый код, во многом определяют функциональное состояние хроматина. Изучение гистонового кода, ввиду его высокой сложности и важности в определении состояния клетки, представляет собой актуальную фундаментальную задачу. Важно отметить универсальный характер этой проблемы, ведь поддержание и изменения структурно-функциональных особенностей хроматина лежат в основе многих, если не всех базовых биологических процессов (клеточное деление, самоподдержание и дифференцировка стволовых клеток, клеточная (де)дифференцировка, клеточное старение, раковая трансформация и др.). Ключевую роль в “интерпретации” гистонового кода клеткой играют домены, специфически связывающиеся с модифицированными гистонами (histone modification reader domains, HMRD); они привлекают белки со специфическими активностями, необходимыми в данном локусе хроматина. Внесение, распознавание и удаление гистоновых модификаций представляет собой динамическую и регулируемую на многих уровнях систему. Важную методическую роль в изучении гистонового кода играют моноклональные антитела, специфически связывающиеся с теми или иными посттрансляционными модификациями гистонов. Такие антитела позволили получить основную информацию о функциональном значении модификаций гистонов с помощью метода ChIP-Seq, включающего в себя иммунопреципитацию хроматина и последующее высокопроизводительное секвенирование ДНК. Одной из основных проблем методологии ChIP-Seq является усреднение данных по всем клеткам в анализируемом образце. Именно поэтому разработка инструментов и методологии изучения эпигенетических модификаций на уровне отдельных живых клеток крайне актуальна и позволит впервые наблюдать за общей картиной изменений в эухроматине. Для создания нового типа сенсоров для визуализации эпигенетических модификаций гистонов в реальном времени мы будем использовать недавно разработанную оптогенетическую систему для светоиндуцированного белок-белкового взаимодействия. Одной из наиболее успешных фотодимеризующихся пар является пара белковых доменов под названием Магниты (Magnets), созданные на основе фоторецептора Vivid (VVD) из Нейроспоры густой (Neurospora crassa). Под воздействием синего света мономер VVD претерпевает конформационные изменения, что приводит к формированию димера, и следовательно, делает возможной обратимую светозависимую димеризацию изучаемых белков. Настоящий проект направлен на разработку новой методологии оценки эпигенетических модификаций гистонов на уровне единичных живых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Предлагаемый метод основан на использовании ранее созданного в нашей лаборатории сенсора, представляющего собой соединенный с флуоресцентным белком природный белковый домен, специфически связывающийся с модификацией гистона H3K4me1, ассоциированной с активными генными энхансерами. Новый генетически кодируемый флуоресцентный сенсор позволит визуализировать ландшафт распределения H3K4me1 в ядрах живых клеток с минимальным вмешательством в структурную и физиологическую целостность клетки благодаря обратимой светозависимой активации и быстрой диссоциации фотодимеризующихся белковых доменов.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будет разработан новый подход к анализу эпигенетических модификаций гистонов. Метод основан на создании химерного белкового флуоресцентного зонда, включающего несколько основных элементов: 1) “ридерный” домен, связывающийся с модифицированным гистоном; 2) флуоресцентный белок для визуализации в живых клетках; 3) оптогенетический домен для светозависимой димеризации, обеспечивающий связывание зонда с хроматином только после облучения светом. Данный метод будет апробирован на примере монометилирования лизина-4 гистона Н3 (H3K4me1) - модификации, характерной для активных генных энхансеров. Благодаря модульному строению, в дальнейшем данный зонд может быть легко модифицирован для узнавания других модификаций гистонов. По сравнению с имеющимися технологиями анализа эпигенома, новый метод, как ожидается, будет обладать несколькими ключевыми преимуществами: - Возможность наблюдать внутриядерное распределение целевой модификации на уровне единичных живых клеток в динамике, в том числе, в ходе разнообразных процессов, например, при ответе на стресс или при дифференцировке. Это позволит выявлять ключевые моменты, когда происходит существенные перестройки эпигенома, и далее анализировать их подробно. - Минимальное влияние на физиологию клетки за счет светоиндуцированной активации связывания (т.е. большую часть времени зонд не связан с хроматином и не мешает эндогенным факторам связываться с целевой модификацией). - Природная (контекст-зависимая) специфичность ридерных доменов. Это позволит получать более биологически релевантные данные по сравнению с антителами. - Возможность анализировать методом ChIP-Seq только целевую популяцию клеток, экспрессирующих зонд за счет использования ткане-специфических генных промоторов. Это позволит изучать эпигеном определенных клеточных типов в составе гетерогенных образцов - организмов, тканей, органоидов, ко-культур и пр. - “Идеальный” отрицательный контроль для анализа методом ChIP-Seq. Светозависимая димеризация, обеспечивающая связывание зонда, дает возможность провести ChIP-Seq на одной и той же линии клеток до и после облучения, используя одни и те же антитела, полностью унифицируя процедуру для целевого образца и отрицательного контроля.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетном периоде был разработан ряд сенсоров для анализа эпигенетических модификаций гистонов. Метод работы сенсоров основан на создании генетически кодируемых флуоресцентных зондов, включающих несколько основных элементов: 1) ридерный домен, связывающийся с модифицированным гистоном; 2) фоточувствительный домен для светозависимой димеризации, обеспечивающий связывание зонда с гистоном только после облучения светом; 3) флуоресцентный белок для визуализации в живых клетках. - Было создано пять вариантов сенсора для визуализации монометилирования лизина-4 гистона Н3 (H3K4me1) - модификации, характерной для активных генных энхансеров. Сенсоры, получившие названия eMag1-DPF3 и eMag2-DPF3, продемонстрировали низкую эффективность фотодимеризации, однако показали достаточно хорошую визуализацию эпигенетических паттернов (Рис. 1 Б). Сенсоры, в которых для фотодимеризации использовалась фоточувствительная пара доменов VVD (VVD1, VVD2, VVD3), не продемонстрировали сродства к H3K4me1 при всех испробованных вариантах индукции димеризации. - Был также создан один вариант сенсора для визуализации ацетилирования лизина-9 гистона Н3 (H3K9ac). Данный сенсор (eMag-AF9) также не позволил выявить паттерны, соответствующие распределению модификации H3K9ac в ядре. - Было создано три варианта сенсора для визуализации триметилирования лизина-9 гистона Н3 (H3K9me3) - модификации, характерной для гетерохроматина. Все три сенсора (nMagHigh1, pMagFast2 и pMagFast2-nMagHigh1) позволили эффективно визуализировать архитектуру эпигенетических модификаций H3K9me3, однако выявление флуоресцентных паттернов происходило еще до облучения синим светом (Рис. 5 Б).

 

Публикации

1. Мошарева М.А., Лукьянов К.А., Путляева Л.В. Fluorescence imaging of epigenetic genome modifications Elsevier, Выпуск 622, стр. 86-92 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2022.07.014

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Были созданы генно-инженерные конструкции для фотоиндуцируемой визуализации модификации H3K9me3 (MPP8-LAMS) и H3K9ac (AF9-LAMS) с использованием фотоактивируемого домена AsLOV2. Мы обнаружили, что максимальная степень транслокации созданных зондов из цитоплазмы в ядро достигается за 20 мин облучения короткими импульсами (длительностью 1 с.) синего света (488 нм) каждые 30 с. 2. Было обнаружено, что MPP8-LAMS подвергается полной транслокации обратно в цитозплазму через 70–80 мин после изначального облучения синим светом. 3. Также была оценена специфичность фотоактивации MPP8-LAMS: было показано, что созданный сенсор специфически связывается с модификацией H3K9me3 только при воздействии света с длиной волны 488 нм; и иммунохимическое окрашивание клеток, продемонстрировавшее колокализацию флуоресцентных паттернов, визуализированных с помощью антител анти H3K9me3 и MPP8-LAMS. 4. С помощью XRCC1-EYFP была продемонстрирована низкая фототоксичность протокола индукции экспрессии MPP8-LAMS в клетках. 5. С помощью метода анализа эпигенома LiveMIEL было показано, что флуоресцентные паттерны, полученных с помощью фотоиндуцируемого сенсора MPP8-LAMS, схожи с паттернами, полученными с помощью охарактеризованного ранее сенсора MPP8-Katushka. 6. Мы создали новую генетически кодируемую светоиндуцируемую систему сенсоров LANS с минимальным уровнем токсического воздействия на клетки, позволяющую визуализировать ядрышко клетки в реальном времени. Комбинация домена eMag для светоиндуцируемой димеризации и ридерного домена белка DPF3 позволяет системе LANS эффективно осуществлять направленное перемещение целевого белка в ядрышко посредством облучения клетки короткими импульсами синего света.

 

Публикации

1. Журлова П.А., Беседовская З.В., Соколинская Е.Л., Путляева Л.В. Genetically encoded light-inducible sensor for nucleolar visualization Bulletin of Russian State Medical University, выпуск 6, 2023 год (год публикации - 2023) https://doi.org/10.24075/brsmu.2023.048

Возможность практического использования результатов
В данной работе описана новая генетически кодируемая система флуоресцентных сенсоров (light-activated nucleolus sensors, LANS) для визуализации ядрышка в реальном времени. LANS использует преимущества светозависимой димеризации системы eMags, что позволяет использовать данный сенсор для светоиндуцируемого рекрутирования целевых белков. Сенсоры LANS могут быть полезны для проведения биомедицинских исследований, а именно тестирования препаратов, оказывающих влияние на ядрышки, а также ускорить поиск новых лекарств и улучшить первичный скрининг лекарственных соединений в моделях in vivo. Также мы создали ряд сенсор MPP8-LAMS для детального анализа представленности модификации гистона H3K9me3 на уровне единичной клетки. Новый светозависимый сенсор, обратимо связывающийся с модификацией гистона H3K9me3 позволяет визуализировать эпигенетический ландшафт отдельных живых клеток с наименьшим токсическим эффектом за счет использования улучшенных систем димеризующихся белков. Созданный сенсор обогатил арсенал методов по анализу модификаций гистонов в широком спектре экспериментальных моделей.