Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Кислоточувствительные ионные каналы (ASICs – Acid-Sensing Ion Channels) активируются в ответ на снижение значения внеклеточного рН в тканях организма и обладают важной сенсорной и регуляторной функцией в нейронах как периферической, так и центральной нервной системы. Ацидоз тканей, возникающий в результате механических повреждений, развития опухоли, воспаления или более серьезных патологических процессов, сопровождающих нейродегенеративные заболевания, вызывает боль, которая резко снижает качество жизни человека. Все известные низкомолекулярные модуляторы ASIC каналов (амилоридные и нестероидные противовоспалительные препараты, FMRF-амиды) являются неселективными и/или малоэффективными, или вызывающими нежелательные побочные эффекты, что сильно ограничивает возможность их применения. Поэтому поиск новых молекул, специфично действующих на молекулярные механизмы генерации боли с минимальными побочными эффектами, является весьма актуальной задачей. Яд морских анемон богат биологически активными пептидами, включая модуляторы ASIC каналов, обладающие анальгетической и противовоспалительной активностью, и представляет интерес как источник новых потенциальных лекарственных препаратов. В рамках работ по проекту на первом этапе из мукуса морских анемон Heteractis magnifica хроматографическими методами были выделены четыре APETx-подобных пептида, в том числе два новых, названные Hmg 1b-2 Metox и Hmg 1b-5. Последовательности пептидов были определены методом тандемной масс-спектрометрии. Hmg 1b-5 (41 а.о.) отличается пятью аминокислотными остатками от своих ближайших гомологов. Hmg 1b-2 Metox является производным пептида Hmg 1b-2 с окисленным Met16. Установлено, что APETx-подобные пептиды H. magnifica являются новыми лигандами ацетил-холиновых рецепторов (nAChR) мышечного и α7 типов. Пептид Hmg 1b-2 обладал широкой специфичностью, он ингибировал не только ASIC1 и ASIC3 каналы, но и модулировал работу 14-ти подтипов потенциал-зависимых калиевых, 9-ти подтипов натриевых и 3-х подтипов кальциевых каналов, а также избирательно потенцировал вызванный ацетилхолином ток α7, но не nAChR мышечного типа, экспрессированных в ооцитах Xenopus laevis. Показано, что окисление Met16 в Hmg 1b-2 отменяет его ингибирующее действие на каналы ASIC, при сохранении способности конкурировать с радиоактивно меченым α-бунгаротоксином за связывание с nAChR мышечного типа. Новый пептид Hmg 1b-5, в отличие от своих гомологов, ингибировал только ASIC3. Эффективность пептидов Hmg 1b-2 и Hmg 1b-4, как потенциальных анальгетиков и противовоспалительных препаратов, доказана в экспериментах на животных. Пептиды при внутривенном введении мышам достоверно снижали количество и продолжительность корчей, вызванных введением уксусной кислоты. В модели острого местного воспаления, индуцированного λ-каррагинаном, пептиды в дозах 1 и 0,1 мг/кг оказывали достоверное противовоспалительное действие, существенно ингибируя рост воспалительного отёка лапы мышей по сравнению с контрольной группой. Противовоспалительная активность пептида Hmg 1b-4 была в разы выше не только активности его гомолога Hmg 1b-2, но и коммерческого препарата группы НПВП, Диклофенака. Кроме того установлено, что пептид Hmg 1b-2 не оказывает угнетающего действия на ЦНС и обладает выраженным анксиолитическим эффектом. Методами молекулярной биологии и генетической инженерии доказано, что APETx-подобные пептиды формируют в организме-продуценте, H. magnifica, комбинаторную библиотеку в виде множества изоформ с точечными аминокислотными заменами. На основании данных, полученных в результате применения техники 3’- и 5’-RACE, были собраны последовательности транскриптов, кодирующие пептиды Hmg 1b-2 и Hmg 1b-5. Кроме того обнаружено пять различных групп генов APETx-подобных пептидов, имеющих общую экзон-интрон-экзонную структуру, в которой интроны разной длины приходятся на область, кодирующую пропептид. Установлена последовательность гена, кодирующего пептид Hmg 1b-5. На основании анализа (in silico) поверхностного электростатического потенциала и ориентации дипольного момента все APETx-подобные пептиды комбинаторной библиотеки группируются с пептидами-гомологами, способными модулировать ASIC каналы.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Ацидоз (увеличение кислотности) тканей, возникающий в результате механических повреждений, воспаления или других серьезных патологических процессов, например, онкологических или нейродегенеративных, вызывает боль, которая резко снижает качество жизни человека. Кислоточувствительные ионные каналы (ASIC каналы), обнаруженные повсеместно в теле организма, ответственны за восприятие снижения внеклеточного значения рН, и, таким образом, участвуют как в физиологических, так и в патологических процессах. Поиск и изучение новых лигандов, модуляторов ASIC каналов пептидной природы, представляет собой актуальное направление исследования ввиду их возможного использования в качестве инструментов для функциональной характеристики разных изоформ ASIC каналов, а также в качестве основы для создания новых анальгетических препаратов. Известно, что яды морских анемон являются ценным источником пептидных молекул, способных специфично модулировать различные типы ионных каналов, в том числе ASIC, а также проявлять анальгетическую и противовоспалительную активности. В рамках работ по гранту на втором этапе реализации проекта была разработана система бактериальной продукции и получен функционально активный рекомбинантный APETx-подобный пептид Hmg 1b-4 морской анемоны Heteractis magnifica. Рекомбинантный Hmg 1b-4, как и природный пептид, ингибировал токи экспрессированных в ооцитах Xenopus laevis крысиных каналов ASIC1a и потенцировал токи ASIC3 на 45 и 29% соответственно, но, как и Hmg 1b-2, ингибировал на 25% быструю компоненту тока ASIC3-∆20 человека. Впервые показано, что Hmg 1b-2 является лигандом пуринергических P2X7 рецепторов и достоверно ингибирует пять из восьми исследованных потенциал-зависимых калиевых каналов подтипа 7, максимально (~60%) блокируя токи гетеромерных каналов Kv7.3/7.5. В экспериментах на животных показано, что Hmg 1b-2 и Hmg 1b-4 не токсичны при внутривенном введении мышам в дозе 1 мг/кг. Прямая инъекция Hmg 1b-4 в дозе 1 мг/кг в подушечку задней лапы мыши не вызывала ноцицептивной реакции. На модели острого воспаления задней лапы мышей, индуцированного полным адъювантом Фрейнда, доказана эффективность пептида Hmg 1b-4 как потенциального противовоспалительного препарата. Пептид Hmg 1b-4 во всех тестируемых дозах ингибировал рост воспалительного отёка лапы мышей по сравнению с контрольной группой и группами, инъецируемыми диклофенаком и Hmg 1b-2, при этом более выражен был эффект пептида в дозе 1 мг/кг. Показано, что оба пептида достоверно повышали исследовательскую активность и снижали тревожность мышей. Однако Hmg 1b-2 оказывал незначительное возбуждающее действие на ЦНС, увеличивая параметры пройденного расстояния и скорости движения животных примерно в 1,5 раза по сравнению с таковыми контрольной группы. В группах животных, инъецированных Hmg 1b-4, наблюдалось умеренное увеличение времени активности, обусловленное стимуляцией исследовательской мотивации и активного поискового поведения, а не возбудимости, что свидетельствует о его противотревожном и возможном нейропротекторном эффекте. В результате in silico анализа аминокислотных остатков, величины и направления дипольных моментов, а также молекулярного электростатического потенциала пептидов Hmg 1b-2, Hmg 1b-4 и 10 его мутантов, выявлено четыре кластера пептидов с различными электростатическими свойствами. Показано, что изменение числа положительно заряженных остатков в молекуле, вероятно, не приведет к значительному увеличению активности Hmg 1b-4.