Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1) Был рассмотрен так называемый «нелокальный» механизм образования пор в замкнутых мембранах под действием амфипатических пептидов. При адсорбции и частичном встраивании амфипатических пептидов в наружный монослой замкнутой мембраны (например, везикулы) в наружном монослое возникает латеральное давление, а во внутреннем монослое — равной величины латеральное натяжение. Согласно данному гипотетическому механизму порации, такое асимметричное латеральное давление/натяжение в наружном/внутреннем монослях замкнутой мембраны может индуцировать образование пор. В рамках теории упругости липидных мембран была рассчитана оптимальная непрерывная обратимая траектория образования поры в мембране с асимметричным латеральным давлением/натяжением. Было показано, что асимметричное латеральное давление/натяжение, возникающее в замкнутой мембране при встраивании в наружный монослой амфипатических пептидов, не стимулирует, а, напротив, затрудняет образование пор. Таким образом, был сделан вывод, что поры образуются по «локальному» механизму, в ближайшей окрестности молекул амфипатических пептидов, которые непосредственно участвуют в формировании кромки поры, что обеспечивает чувствительность порации к конкретной физической/химической структуре пептида. 2) Для нахождения средней электрической проводимости липидного бислоя в зависимости от концентраций амфипатических и полуторных пептидов, а также других возможных мембранных включений была предложена и реализована статистическая модель, учитывающее взаимодействие всех мембранных включений посредством индуцируемых ими деформаций мембраны. В рамках теории упругости липидных мембраны были рассчитаны энергии различных конфигураций мембранных включений (амфипатических, полуторных и трансмембранных пептидов, а также гидрофобных дефектов и гидрофильных пор) и получены потенциалы взаимодействий проводящих дефектов мембраны (гидрофобных дефектов и гидрофильных пор разных радиусов) с амфипатическими, полуторными и трансмембранными пептидами. Была составлена и вычислена статистическая сумма, из которой было вычислено среднее число проводящих дефектов фиксированного радиуса и средняя проводимость мембраны по ионам известного размера в зависимости от концентрации пептидов на липидной мембране. Было показано, что наличие любых мембранных пептидов перенормирует энергию проводящих дефектов, и была количественно найдена эта перенормировка. Получена зависимость проводимости мембраны от концентраций пептидов на мембране. Было показано, что добавление амфипатического пептида многократно увеличивает проводимость мембраны в области практически значимых концентраций. Зависимость проводимости мембраны от концентрации пептидов была обобщена на случай одновременного наличия нескольких типов пептидов, встроенных в мембрану. Помимо этого, было теоретически предсказано существование мембранных включений, подавляющих возникновение проводящих дефектов некоторых радиусов, т.е. являющихся своего рода ингибиторами проводимости мембраны по определенным ионам. 3) Было показано, что в модельных мембранах наличие твердой подложки или латерального натяжения влияет на энергию деформаций, индуцированных частично встроенными в мембрану амфипатическими пептидами. Было получено, что в мембранах на твердой подложке энергия возрастает, а в мембранах с латеральным натяжением -- уменьшается, что должно приводить к различию поверхностной концентрации пептидов на этих мембранах приблизительно в 5 раз по сравнению со свободной ненатянутой мембраной. Сделан вывод, что при сопоставлении результатов, получаемых на модельных и клеточных мембранах, необходимо учитывать данное различие поверхностных концентраций пептидов при одной и той же объемной концентрации. 4) Из расчетов в рамках разработанной статистической модели оказалось, что принципиальная структура деформаций, индуцируемых полуторными пептидами, относительно слабо усиливает образование пор амфипатическими пептидами. Расчеты показали, что наибольшее усиление порации обеспечивается трансмембранными пептидами, длина которых меньше толщины бислоя, и которые сжимают мембрану. В связи с этим в качестве усилителей порообразующей активности амфипатических пептидов были рассмотрены относительно короткие трансмембранные пептиды. Оптимизация структуры пептида была проведена методами полноатомной молекулярной динамики (МД) и по результатам в качестве оптимального был выбран пептид p23 (GGKKLALALALALALALALALWWAG). Было показано, что пептид p23 в процессе МД сохраняет в мембране спиральную структуру. Также он сохраняет свою трансмембранную ориентацию, взаимодействуя полярными группами и ароматическими остатками с полярными группами липидных молекул, расположенных в разных монослоях. Пептид влияет на форму мембраны в области связывания -- в окрестности пептида мембрана становится тоньше, что, согласно разработанной статистической модели, должно существенно усиливать порообразующую активность амфипатических пепитдов. В мембраны, содержащие холестерин и липиды с насыщенными углеводородными цепями, пептид p23 не встраивается в трансмембранную конфигурацию, а остается связанным с поверхностью монослоя. Таким образом, в мембранах клеток млекопитающих пептид p23 не способен усиливать порообразующую активность амфипатических пептидов, что дополнительно повышает специфичность данного потенциального противомикробного препарата. По данным https://tisigner.com/sodope растворимость пептида p23 составляет 23%. 5) По результатам моделирования МД было принято решение синтезировать пептид p23, как оптимальный для целенаправленной модификации структуры деформационных полей мембраны. Был проведен синтез пептида GAWWLALALALALALALALKKGG по протоколу твердофазного пептидного синтеза. Получен препарат данного пептида. 6) Был проведен анализ вторичной структуры модельного амфипатического пептида -- H0 спирали ENTH домена белка эпсина, в воде и в связанном с мембраной состоянии. Было показано, что в воде данный пепитд находится в неструктурированном состоянии, а при связывании с мембраной приобретает альфа-спиральную вторичную структуру, причем степень спиральности зависит от липидного состава мембраны. Показана каталитическая роль липидов с полярной головкой фосфатидилэтаноламином в привлечении и встраивании амфипатического H0 пептида в липидный бислой.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1) Было экспериментально исследовано влияния трансмембранного пептида р23 (GAWWLALALALALALALALKKGG) на порообразующую активность амфипатического пептида р1545 (FLIGKAIKRKFCLRSVWNA). Была получена зависимость электрической проводимости модельных мембран, имитирующих по составу плазматические мембраны бактериальных клеток и клеток млекопитающих, от объемной концентрации добавляемого с одной стороны мембраны амфипатического пептида р1545 (FLIGKAIKRKFCLRSVWNA) вырабатываемого пиявками Hirudo medicinalis. Показано, что в мембранах, липидный состав которых имитирует бактериальные мембраны, пептид р1545 при добавлении в большой объемной концентрации (~3 мг/л) образует проводящие поры. Трансмембранный пептид р23 (GAWWLALALALALALALALKKGG) порообразующей активности не проявляет. Однако после предварительной инкубации мембран с пептидом р23 при последующей добавке пептида р1545 интенсивность образования пор значительно увеличивается. При этом в мембранах, состав которых имитирует наружные монослои плазматических мембран клеток млекопитающих, поры вообще не образуются во всем исследованном диапазоне объемных концентраций пептидов р23 и р1545. Таким образом, встроенный в мембрану пептид p23 значительно усиливает порообразующую активность амфипатического пептида р1545 избирательно, в модельных мембранах, имитирующих по составу плазматические мембраны бактериальных клеток, в то время как в мембранах, имитирующих плазматические мембраны клеток млекопитающих, порообразующая активность пептида р1545 экспериментально не регистрируется. 2) Разработана теоретическая статистическая модель, позволяющая предсказывать среднее время жизни каналов и интегральную электрическую проводимость (среднее количество каналов) мембраны со встроенными мономерами грамицидина А в присутствие амфипатических пептидов и/или коротких трансмембранных пептидов в заданной концентрации. Для расчета зависимости среднего времени жизни каналов и интегральной электрической проводимости мембраны с встроенными мономерами грамицидина А, амфипатическими пептидами и/или короткими трансмембранными пептидами от концентрации всех пептидных компонентов использовался метод кластерного разложения Майера, позволяющий найти статистическую сумму системы с учетом латерального взаимодействия компонентов посредством деформаций мембраны. Липидный бислой рассматривался как непрерывная упругая среда, энергия деформаций которого рассчитывалась в рамках соответствующей теории упругости с использованием функционала упругой энергии. Равновесное распределение деформаций находилось путем минимизации этого функционала. При этом считалось, что амфипатические и трансмембранные пептиды не деформируются, но налагают граничные условия на деформации липидной мембраны. Для применения кластерного разложения Майера необходимо рассчитать энергии парных взаимодействий всех деформирующих мембрану объектов: мономеров, коаксиальных пар и димеров грамицидина, амфипатических пептидов, трансмембранных пептидов -- «всех со всеми». Далее эти энергии используются для построения функций Майера, которые потом комбинируются в кластерные интегралы, из которых конструируется статистическая сумма системы с учетом взаимодействий мембранных включений. Было показано, что при наличии в мембране каждого вида пептидов (амфипатический и трансмембранный) увеличивается среднее время жизни каналов грамицидина и растет их интегральная проводимость, т.е. увеличивается среднее количество проводящих димеров. В первом порядке по концентрациям амфипатических и трансмембранных пептидов, эффект усиления аддитивен при одновременном встраивании двух видов пептидов в мембрану, однако коэффициенты, стоящие перед концентрацией трансмембранных пептидов, приблизительно на два порядка величины больше, чем коэффициенты при концентрации амфипатических пептидов. Таким образом, согласно предсказаниям разработанной теоретической модели, увеличение среднего времени жизни проводящего состояния грамицидина и интегральной проводимости мембраны при добавлении одновременно амфипатических и трансмембранных пептидов должно быть аддитивно, однако эффект трансмембранных пептидов значительно больший, чем амфипатических. 3) Для определения механизма перехода мономеров грамицидина А из одного липидного монослоя мембраны в другой была разработана статистическая модель образования дефектов в мембране вблизи мономеров грамицидина А. Модель предполагает, что сквозной мембранный дефект и мономер грамицидина взаимодействуют посредством деформаций мембраны. В рамках теории упругости липидных мембран были рассчитаны энергии парных взаимодействий мономера грамицидина А и гидрофобных дефектов. Было показано, что мономер грамицидина и сквозной мембранный дефект притягиваются посредством деформаций мембраны. Парные потенциалы взаимодействий затем использовались для построения функций Майера; путем численного интегрирования этих функций по всем возможных конфигурациям мономера грамицидина А и сквозного дефекта получались майеровские интегралы, которые позволяют сконструировать статистическую сумму системы. Из рассчитанной статистической суммы было показано, что мономеры грамицидина способствуют образованию в мембране сквозных дефектов, через стенку которых возможен переход мономеров грамицидина из одного монослоя мембраны в другой. Короткие трансмембранные пептиды также способствуют образованию таких дефектов, и, таким образом, должны ускорять флип-флоп грамицидина. Кроме того, для объяснения экспериментальных данных по ускорению флип-флопа и увеличению среднего количества проводящих димеров грамицидина в присутствие бычьего сывороточного альбумина (БСА) была разработана теоретическая статистическая модель, в которой предполагалось, что БСА при электростатическом взаимодействии с мембраной локально латерально конденсирует липидные молекулы, что приводит к увеличению толщины, модуля изгиба и спонтанной кривизны участка монослоя под адсорбированной молекулой БСА. Такие участки отталкиваются от мономеров грамицидина, расположенных в том же монослое, и притягивают мономеры в противоположном монослое за счет упругих деформаций мембраны. При этом средняя энергия мономеров грамицидина в монослое с БСА увеличивается, а в противоположном монослое -- уменьшается, что и приводит к ускорению выравнивания концентрации мономеров грамицидина в монослоях мембраны. Кроме того, теоретически показано, что в присутствие БСА должно резко увеличиваться среднее количество димеров грамицидина в мембране при симметричной адсорбции грамицидина и БСА. Предполагается, что с отрицательно заряженными мембранами бактериальных клеток электростатическое взаимодействие молекул БСА будет значительно сильнее, чем с нейтральным наружными монослоями плазматических мембран клеток млекопитающих. Таким образом, избирательное повышение скорости флип-флопа грамицидина А за счет адсорбции БСА может служить дополнительным фактором усиления активности грамицидина А в мембранах бактериальных клеток.