Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Известно, что в результате определённых условий белки могут терять свою нативную укладку. Процесс неправильного сворачивания белков часто приводит к агрегации и преципитации белков, при этом агрегаты принимают форму либо высокоупорядоченных структур (амилоидные фибриллы), либо неупорядоченные формы (аморфные агрегаты). Амилоидная агрегация получила широкую известность благодаря тому, что является одним из ключевых процессов при развитии различных неизлечимых заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, Крейтцфельдта-Якоба, а также диабет II типа и др. На сегодняшний день амилоиды определяются как агрегаты «неправильно» свернутого пептида или белка, которые имеют кросс-β структуру, что способствует их повышенной устойчивости к протеолитической деградации. В большинстве случаев процесс амилоидообразования неизменно связан с развитием отдельных заболеваний, однако амилоиды играют важную функциональную роль и в здоровом организме. Например, амилоиды, формируемые протеолитическими фрагментами белка Pmel17 в меланосомах, защищают клетки от токсического действия предшественников меланина. Функциональные амилоиды обнаружены в тканях и органах различных организмов (бактерий, растений, животных). Объектом нашего исследования является гигантский мышечный белок титин (тайтин/коннектин), открытый в конце 70-х гг. прошлого века. К настоящему времени показано, что альтернативный сплайсинг гена титина (ttn) приводит к образованию разных по длине изоформ этого белка с м.м. ~2000–3900 кДа в поперечно-полосатых мышцах животных. В гладких мышцах позвоночных обнаружены изоформы титина с молекулярной массой 500–2000 кДа. Исследования, проведённые нами ранее на препаратах титина, изолированных из гладких мышц (м.м. 500 и 1500 кДа), выявили способность разных изоформ этого белка формировать олигомеры и крупные агрегаты. Исследования структуры и свойств агрегатов гладкомышечного титина выявили их амилоидную природу. Сделано предположение, что подобный тип агрегации возможен в организме и имеет функциональное значение, например, регулирует упруго-эластичные свойства мышечных клеток. В рамках этого проекта исследованы агрегационные свойства скелетно-мышечного титина и миозин-связывающего белка С (С-белка), а также их комплексообразования in vitro. Оба белка (и титин, и С-белок) являются структурными (белками саркомерного цитоскелета); состоят из Ig- и FnIII-подобных доменов, представляющих собой β-сэндвич-домены с двумя противоположными антипараллельными β-листами. Ранее нами была показана способность быстрого паралога миозин-связывающего белка С формировать амилоидные агрегаты in vitro. В этом проекте мы планируем изучить особенности процесса формирования временной или постоянной амилоидной структуры (кросс-β структуры) при взаимодействии молекул титина и С-белка в процессе формировании их комплексов in vitro. Подобные исследования помогут понять возможную функциональную роль такого рода взаимодействия между белками в мышечных клетках. В рамках первого года реализации проекта ставились задачи по изучению агрегации отдельно скелетно-мышечного титина, а также комплексов титина и С-белка. Изучение агрегации отдельно для С-белка не планировалось, поскольку эти данные были получены нами ранее. Известно, что миозин связывающий белок С имеет два паралога: экспрессирующийся преимущественно в «быстрых» мышечных волокнах (С-белок) и – в «медленных» мышечных волокнах (прежнее название Х-белок). В настоящее время оба паралога принято называть термином «С-белок». Для исследования комплексообразования с титином был выбран «быстрый» паралог С-белка, агрегаты которого имеют кросс-β структуру, присущую амилоидам. Х-белок не был выбран для исследований, поскольку, по нашим данным, его агрегаты (аморфные, протофибриллы, фибриллы) не имели четвертичной кросс-β структуры. С помощью атомно-силовой микроскопии обнаружено, что титин скелетных мышц кролика в растворе, содержащем 200 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0 формируют структуры, напоминающую структуру губку. Нити данных агрегатов имели высоту 4-5 нм. В растворе, содержащем 0.15 М глицин-KOH, рН 7.0 агрегаты титина были представлены в виде ветвящихся цепочек, состоящих из сферических агрегатов диаметром около 100-200 нм и высотой 20-50 нм. По данным электронной микроскопии скелетный титин в растворе, содержащем 0,15 М глицин-КОН, рН 7.0, также формировал аморфные агрегаты, состоящие из более крупных частиц, чем те, которые были визуализированы методом АСМ. Выявленные несоответствия, по всей вероятности, являются следствием различной подготовки образцов для АСМ и ЭМ. Тем не менее, полученные результаты сопоставимы. Для формирования комплекса «титин/С-белок» нами были выбраны следующие условия: 150 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0; 175 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0 и 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0. Выбор условий сводился к следующему: желательно чтобы ионная сила была близкой к физиологическим значениям. Поэтому были выбраны два раствора, содержащие 150 мМ и 175 мМ KCl. Для сравнения результатов также был выбран раствор, ионная сила которого ниже физиологической (содержащий 30 мМ KCl). Методом атомно-силовой микроскопии мы показали, что в растворе, содержащем 150 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0, белки коагрегировали в структуры, которые можно описать как сферические агрегаты диаметром 100-500 нм и высотой до 50-200 нм. Агрегаты распределялись в поле зрения либо в виде случайных скоплений сферических структур, либо в виде ветвящихся структур, также состоящих из сферических агрегатов. В растворе 175 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0 агрегаты комплексов «титин/С-белок» были представлены в виде плёнки, распределённой по всему полю зрения. Поверхность плёнки была неравномерной и изредка на ней можно было наблюдать крупные сферические частицы. В растворе 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0 агрегаты комплексов «титин/С-белок» формировали структуру, напоминающую плёнку высотой до 60 нм, перекрывающую все поле зрения. Структуры, полученные в данных исследованиях морфологически отличны от структур, которые образуют титин и С-белок отдельно, следовательно дальнейшее изучение структурных особенностей комплексов «титин/С-белок» будет проведено в выбранных нами условиях: 50 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0, 175 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0 и 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0. Таким образом, достигнутые результаты полностью соответствовали нашим ожиданиям на заявленный период выполнения проекта. В следующем году методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и рентгеновской дифракции предполагается изучить структуру полученных белковых комплексов, сформированных в описанных выше условиях.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках этого проекта исследованы агрегационные свойства скелетномышечного титина, а также комплексообразование титина и С-белка invitro. Оба белка (и титин, и С-белок) являются структурными – белками саркомерного цитоскелета; они состоят из Ig- и FnIII-подобных доменов, представляющих собой β-сэндвич-домены с двумя противоположными антипараллельными β-листами. В рамках первого года реализации проекта ставились задачи по изучению агрегации отдельно скелетномышечного титина, а также комплексов титина и С-белка. Изучение агрегации отдельно для С-белка не планировалось, поскольку эти данные были получены нами ранее. Для исследования комплексообразования с титином был выбран «быстрый» паралог миозин-связывающего белка С (С-белка). Первой задачей второго года реализации проекта заключалась в исследовании вторичной структуры полученных агрегатов титина и комплексов «титин/С-белок» методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье. В образцах титина имеется большой процент неупорядоченной структуры и в процессе агрегации количество неупорядоченности растет. У агрегатов титина, сформированных в растворе, содержащем 200 мМ KCl, отсутствуют α-спиральные участки и увеличивается процент β-складок по сравнению с неагрегированной формой белка. Скелетномышечный титин в неагрегированной форме имеет спектр поглощения с широкой полосой амида I' и с максимумом при ~1637 см-1, что характеризует данный белок как нативный белок со структурой β-листа. Фибриллы титина, сформированные в растворе, содержащем KCl, дают спектр полосы амида I' с двумя пиками одинаковой интенсивности: 1619 см-1 и 1670см-1. Пик с максимумом ~1619 см-1 относится к «амилоидным», однако по форме является очень широким, и можно предположить, что наличие максимума ~1619 см-1 может указывать на межмолекулярную водородную связь при отсутствии амилоидной структуры. Фибриллы титина, сформированные в растворе, содержащем глицин, помимо основного пика с максимумом 1665 см-1 имеют явно выраженный низкоинтенсивный пик (слабый по амплитуде пик) на 1627 см-1. Данный пик соответствует характеристикам амилоидных агрегатов. Далее мы провели исследования вторичной структуры комплекса «титин/С-белок». Обнаружено, что в образцах комплексов имеется большой процент неупорядоченной структуры и процент неупорядоченности незначительно выше, чем у агрегатов С-белка, но существенно ниже, чем у агрегатов титина. Также можно отметить, что у комплекса «титин/С-белок», сформированного в растворе 30 мМ KCl, 10 мM имидазола, pH 7.0, отсутствуют α-спиральные участки и существенно выше процент β-складок. Анализируя полученные спектры, необходимо отметить, что комплекс «титин/С-белок», сформированный в растворе 175 мМ KCl, 10 мM имидазола, pH 7.0, имеет спектр поглощения с широкой полосой амида I' и с максимумом при ~1645 см-1, что характеризует данный белок как нативный белок со структурой β-листа. Однако полученный спектр не является равномерным и является очень широким с приблизительными максимумами ~1618 см-1 и ~1680 см-1. При этом первый из них соответствует характеристикам амилоидных агрегатов. Тем не менее, говорить об амилоидной природе данного комплекса, основываясь на данных ИК-Фурье спектроскопии, нельзя. Комплекс «титин/С-белок», сформированный в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мM имидазола, pH 7.0, дает спектр полосы амида I' с двумя широкими пиками одинаковой интенсивности: 1617 см-1 и 1675см-1. Пик с максимумом ~1617 см-1 относится к «амилоидным», однако по форме является очень широким. Скорее всего, наличие максимума ~1617 см-1 может указывать на межмолекулярную водородную связь при отсутствии амилоидной структуры. Исследования амилоидной природы агрегатов титина и комплексов «титин/С-белок» При помощи дифракции рентгеновских лучей для агрегатов титина, сформированных в растворе, содержащем глицин, были выявлены следующие рефлексы: 5.9; 4.6; 4.3; 3.8; 3.6; 3.1; 3.04; 2.97; 2.8; 2.6; 2.53; 2.43 Å; для, агрегатов белка, сформированных в растворе, содержащем 200 мМ KCl, были выявлены следующие значения рефлексов: 18.5; 12.5; 4.1; 3.7; 2.9; 2.48 Å. Наличие ярко выраженного рефлекса 4.6 Å у агрегатов титина, сформированных в глицин-содержащем растворе, характеризует расстояние между полипептидными цепями в кросс-β-структуре амилоидных белков. Проведенные исследования по связыванию агрегатов скелетномышечного титина с красителем ТТ показали, что только один тип агрегатов, которые были сформированы при более низкой ионной силе в растворе, содержащем глицин, связываются с вышеуказанным красителем, тогда как агрегаты, сформированные в растворе, содержащем 200 мМ KCl – нет. Из этого следует, что агрегаты титина, сформированные в растворе с глицином, являются амилоидными, тогда как второй тип агрегатов не является амилоидным. Исследование комплексов «титин/С-белок», сформированных в растворе, содержащем 175 мМ KCl, методом рентгеновской дифракции выявило наличие двух размытых кольцевых рефлексов на 4,7 и 10 Å, характеризующих наличие четвертичной кросс-β-структуры, характерной для всех амилоидных фибрилл. Исследование связывания комплексов «титин/С-белок», сформированных в растворе, содержащем 175 мМ KCl, с красителем тиофлавином Т выявило увеличение интенсивности флуоресценции даже по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя в присутствии агрегатов С-белка. Данные рентгеновской дифракции вместе с данными по связыванию с красителем тиофлавином Т подтверждают, что в комплексе «титин/С-белок», сформированном в растворе, содержащем 175 мМ KCl, содержатся амилоидные структуры. У комплексов «титин/С-белок», сформированных в растворе, содержащем 30 мМ KCl, методом рентгеновской дифракции не выявлено наличие «амилоидных» рефлексов. Наиболее значимый результат в данной работе мы получили при исследовании комплекса «титин/С-белок», сформированного в растворе 175 мМ KCl, 10 мМ имидазола, pH 7.0. Во-первых, мы получили комплексы данных белков в условиях, близких к физиологическим (ионная сила, pH). Во-вторых, нам удалось обнаружить с помощью электронной микроскопии взаимодействие между белками в комплексе: декорирование титина молекулами С-белка. И, самое главное, мы доказали амилоидную природу данного комплекса методом рентгеновской дифракции и методом флуориметрического анализа по связыванию с красителем тиофлавин Т. Что важно, ни титин, ни С-белок отдельно не способны формировать амилоидные агрегаты в подобных условиях. Таким образом, мы впервые доказали амилоидную природу комплексов титина и С-белка in vitro, белков, которые связаны между собой in vivo. Полученные результаты расширяют представления о возможной физиологической роли данных белков и их взаимодействия в мышечных саркомерах. Одно из возможных функциональных значений агрегации этих двух белков in vivo может заключаться в регуляции упруго-эластичных свойств мышц в процессе мышечного сокращения.