КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-24-00661
НазваниеМетоды неинвазивной регуляции проницаемости липид-белковых мембран
РуководительКондрашов Олег Васильевич, Кандидат физико-математических наук
Прежний руководитель Галимзянов Тимур Равильевич, дата замены: 31.01.2023
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физической химии и электрохимии им. А. Н. Фрумкина Российской академии наук, г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2023 г. |
Конкурс№64 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
Ключевые словамеханочувствительные ионные каналы, фотопереключаемые липиды, липидная мембрана, регуляция проницаемости липидного бислоя, упругая деформация, мембранный белок, латеральное давление, молекулярная динамика
Код ГРНТИ34.17.00
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Липидные мембраны являются природным барьером, который ограничивает живые клетки и их органеллы от внешней среды, это свойство применяется и в ряде искусственных систем, в частности, в секвенаторах ДНК или молекулярных сенсорах. Прецизионный контроль транспорта через липидные мембраны является ключевым фактором в клеточной коммуникации и восприятии, а также биоинженерных приложениях. Контролируемое нарушение мембранного барьера может быть использовано при разработках новых антимикробных препаратов, методов доставки требуемых веществ внутрь клеток посредством электропорации, а также с помощью липидных контейнеров с управляемыми физико-химическими свойствами. Существует множество задач, требующих генерации избирательной проницаемости, таких как фильтрация или детектирование различных аналитов, а также секвенирование ДНК и различных биополимеров. Обеспечить подобную контролируемую и избирательную проницаемость мембран возможно только с помощью специальных мембранных каналов обладающей предсказуемой проводимостью и селективностью.
Несмотря на то, что проводимость единичного канала в открытом состоянии обычно слабо зависит от внешних факторов, сам факт его открытия и время открытого состояния может существенно меняться при изменении липидного и белкового состава, латерального натяжения мембраны, а также состава и состояния внешней среды. Хотя данные факторы легко контролируются в лабораторных условиях, изменение их в условиях, предполагающих практическое применение, существенно затруднено. Благодаря недавним разработкам в оптике, генетике и дизайне молекул стало возможным неинвазивным образом вмешиваться в процессы мембранного транспорта с помощью света с точным пространственным и временным контролем. Синтетические фотопереключатели могут быть встроены, например, в молекулы белковых каналов с высокой точностью, что позволяет осуществлять внешний контроль над функциями каналов in vivo. Фоточувствительные амфифильные молекулы позволяют напрямую контролировать организацию бислоя и проницаемость мембраны. На основе этих систем возникают новые подходы к созданию сенсорных систем, а также методов транспортировки и адресной доставки различных веществ. Основными направлениями фоторегуляции проницаемости мембран являются фоточувствительные модификации каналов и соответствующие модификации амфифильных компонентов липидных мембран. При этом более универсальные способы регуляции активности каналов, а именно, фотоиндуцированная модификация механических свойств бислоя, не полагающаяся на аффинность каналов к специфическим мембранным компонентам, исследованы мало.
Основной целью данного проекта является разработка методик неинвазивного контролируемого изменения характеристик мембранных каналов, которые позволят обратимо влиять на проницаемость мембран клеток и искусственных систем без нарушения целостности мембран, используя свойства липидного матрикса мембран, окружающего данные каналы. В качестве базового объекта исследования будут использованы хорошо охарактеризованные каналы: пептидный антибиотик, ионный канал грамицидин A, а также каналы из семейств MscS и MscL (механочувствительные каналы малой и большой проводимости), являющиеся хорошо охарактеризованной модельной системой для изучения ионных каналов, которые реагируют на изменения латерального давления в липидном бислое. В качестве модельного применения предложенной методики мы планируем использовать её для разработки метода измерения спонтанной кривизны липидных компонентов в ламеллярном состоянии – важной задачи в фундаментальной области механики мембран. Для достижения поставленной цели мы планируем исследовать влияние фотопереключаемых липидов на характеристики липидных бислоёв, количественно описать влияние липидного состава и упругих свойств мембраны на активность исследуемых каналов. В результате будут предложены способы использования механочувствительных каналов в качестве системы неинвазивного контроля проницаемости клеточных и модельных мембран с высокой скоростью и точностью с помощью световых стимулов для различных биоинженерных приложений. Актуальность проекта определяется широким охватом различных как фундаментальных, так и биомедицинских и биотехнологических задач, к которым могут быть применены результаты проекта – формирование сенсорных устройств и систем с неинвазивно контролируемой проницаемостью, систем неинвазивного контроля над высвобождением лекарства из липосомальных систем доставки, методов измерения упругих параметров липидных компонентов в ламеллярном состоянии.
Ожидаемые результаты
Целью данного проекта является разработка методики неинвазивного контролируемого изменения характеристик мембранных каналов, которые позволят обратимо влиять на проницаемость мембран искусственных систем и клеток без нарушения их целостности, используя свойства липидного матрикса мембран, окружающего данные каналы. В ходе выполнения проекта мы ожидаем получить следующие результаты:
1. Будут выяснены возможности, условия и степень влияния липидного окружения на функциональные характеристики ионных каналов.
2. Будут предложены способы использования мембранных каналов в качестве системы контроля состояния биологических мембран.
3. Будут разработаны методики неинвазивного контролируемого и обратимого изменения характеристик мембранных каналов, что позволит обратимо влиять на проницаемость различных мембранных систем, используя свойства липидного матрикса, окружающего данные каналы.
Для получения заявленных результатов мы планируем исследовать влияние фотопереключаемых липидов на характеристики липидных бислоёв, и количественно описать влияние липидного состава и упругих свойств мембраны на активность исследуемых каналов. Кроме того, в рамках проекта мы планируем разработать методику измерения характеристик мембраны, в частности, молекулярной геометрии её компонентов, посредством измерения времени жизни проводящего состояния каналов грамицидина А. В ходе выполнения работ планируется получить следующие конкретные результаты:
1. Будет разработана и реализована методика измерения спонтанной кривизны липидов составе липидной мембраны. Для этого будут рассчитаны энергетические вклады липидной компоненты в процессы формирования канала грамицидина в мембранах различного липидного состава, и проведены эксперименты по измерению влияния фотопереключения на характеристики проводимости каналов грамицидина А.
Существующие методики определении спонтанной кривизны основаны на измерении характеристик в смесях липидов в инвертированной гексагональной фазе, представляющей собой совокупность сильно изогнутых монослойных липидных цилиндров, заполненных водой. Определяемая спонтанная кривизна конкретного липида зависит от того, в каком липидном окружении она измерялась. Кроме того, спонтанная кривизна, измеряемая в сильно изогнутых монослойных цилиндрах может отличаться от спонтанной кривизны липида в составе практически плоской бислойной мембраны. Разработанная нами методика позволит измерять спонтанную кривизну липидов в бислойной фазе, для описания которой данная характеристика чаще всего используется. Она будет применена для определения спонтанной кривизны фоточувствительного липида PhoDAG в цис- и транс-состояниях.
2. Будет получено описание влияния фотопереключения PhoDAG на активность встроенных механочувствительных ионных каналов. Для этого будут проанализированы профили латерального давления методами теории упругости липидных мембран, моделью гибких струн, а также с помощью методов молекулярного моделирования. Влияние фото-переключение липида PhoDAG между цис- и транс-состояниями также будет исследовано измерением диаграмм сжатия монослоёв Ленгмюра. Предлагаемые методы успешно дополняют друг друга, а также перекрёстной проверкой позволят получить более надёжные результаты.
Распределение латерального давления по толщине мембраны существенно неоднородно, и разные части встроенного в мембрану канала испытывают различное давление, что влияет на его конформацию. Существенное изменение молекулярной геометрии PhoDAG при фотопереключении должно сильно изменять профиль латерального давления и, соответственно, характеристики активности механочувствительных каналов. Полученные данные о влиянии фотопереключения PhoDAG на упругие характеристики липидного бислоя будут использованы для исследования способов фоторегуляции механочувствительных каналов. В частности, вычисленные и измеренные значения спонтанной кривизны PhoDAG позволят построить модель, количественно описывающую влияние фотопереключения на механочувствительные каналы.
3. С помощью полученных данных о влиянии фото-переключения PhoDAG на профиль латерального давления, методами теории упругости и молекулярной динамики изучить влияние фотопереключения на характеристики открытия и закрытия каналов (MscS и MscL), в частности населённости соответствующих состояний и пороговые натяжения для открытия каналов, а также кластеризацию каналов.
Полученные результаты позволят выяснить возможности, условия и степень влияния липидного окружения на функциональные характеристики ионных каналов; и предложить способы использования механочувствительных каналов в качестве системы неинвазивного контроля проницаемости клеточных и модельных мембран с высокой скоростью и точностью с помощью световых стимулов для различных биоинженерных приложений.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках работ по проекту в отчетном периоде нами было проведено экспериментальное и теоретическое исследование влияния фотопереключаемых липидов (PhoDAG) в цис- и транс-состояниях в составе бислойной мембраны, содержащей мономеры канала грамицидина А, на её интегральную проводимость, а также время жизни проводящего состояния канала. Было показано, что фотопереключение 10% PhoDAG в составе липидного бислоя из транс- в цис-конформацию увеличивает интегральную проводимость мембраны на 65%. При этом толщина мембраны изменяется незначительно – на 6%, а время жизни канала в проводящем состоянии изменяется на 50–80% в зависимости от состава мембраны. Таким образом, мы продемонстрировали, что фотоизомеризация in situ PhoDAG обратимо блокирует грамицидин А, выступающий в роли сенсора механических напряжений мембраны. Блокировка происходит вследствие изменения упругих характеристик липидного бислоя, тем самым указывая на применимость фотолипидов, таких как PhoDAG, в качестве регуляторов механочувствительных мембранных белков. Полученные результаты демонстрируют возможность неинвазивной регуляции проводимости мембраны с помощью фотопереключаемого липида PhoDAG.
Экспериментальные данные о фотоиндуцированных изменениях параметров бислоя (изменение толщины, активности) были использованы для измерения упругих характеристик фотопереключаемых липидов. Для этого была построена модель формирования проводящего состояния грамицидина A, позволившая связать упругие характеристики компонентов мембраны, в частности, PhoDAG в трас- и цис- конфигурации, с интегральной проводимостью канала и его временем жизни в проводящем состоянии. С помощью данного метода были измерены спонтанные кривизны липидов ДОФХ, ДФФХ, PhoDAG-транс и PhoDAG-цис.
С целью анализа влияния фотопереключения PhoDAG на упругие свойства мембраны нам была построена модель молекулы данного липида для использования её в молекулярно-динамических расчётах. Ввиду последующего использования данной системы для анализа характеристик крупных механочувствительных каналов мы остановились на крупнозернистой модели данного липида. На первом этапе была построена карта соответствия крупнозернистой модели азобензола (элемента PhoDAG, отвечающего за его фоточувствительность) по отношению к его полноатомной модели. Данные параметры были перенесены для азо-фрагмента, содержащегося в структуре фотопереключаемого липида. Модель была использована для сборки бислоя, содержащего PhoDAG, который на следующем этапе будет использован для анализа характеристик механочувствительных каналов. Было проведено моделирование бислоя, содержащего PhoDAG в цис и транс-конфигурациях, измерен профиль латерального давления в соответствующих бислоях. Профиль позволил оценить влияние фотопереключения на давления в бислое, а также вычислить величины спонтанных кривизн монослоёт PhoDAG в цис и транс-конфигурациях.
С целью экспериментального исследования влияния фотопереключения PhoDAG на механические свойства мембраны, нами были проведено исследование влияния фотопереключения PhoDAG на давление монослоёв путём снятия диаграмм сжатия монослоёв Ленгмюра. Было показано, что изомеризация из транс- в цис-конфигурацию, увеличивает площадь на молекулу липида на 60%, а также сопровождается резким изменением среднего дипольного момента молекулы PhoDAG с –75 до 87 мДб, что демонстрирует конформационный переход при фотопереключении. Измерения позволили оценить спонтанную кривизну PhoDAG-cis, которая согласуется со значениями, полученными другими методиками. Также нами была исследована кинетика фотопереключения, обратимость данного процесса, а также его влияние на давление в липидной мембране.
Таким образом, на данном этапе нами было продемонстрирована возможность существенного влияния фотопереключения PhoDAG на проводимость липидной мембраны, сожержащей грамицидин A. Была разработана методика измерения величин спонтанной кривизны фотопереключаемого липида в составе бислойной мембраны, с помощью которой измерены упругие характеристики компонентов мембраны. Методом диаграмм сжатия монослоёв Ленгмюра было измерено влияние фотопереключения на внутреннее давление и монослоя PhoDAG и продемонстрирована обратимость данного влияния. Также нами нам была построена модель молекулы PhoDAG для использования её в молекулярно-динамических расчётах с механочувствительными каналами, получены профили латерального давления в бислоях, состоящих из PhoDAG в цис- и транс-конфигурациях, которые были использованы для вычисления спонтанных кривизн соответствующих липидов.
Публикации
1. Саитов А., Калуцкий М.А., Галимзянов Т.Р., Глазнов Т, Хорнер А., Акимов С.А., Поль П. Determinants of Lipid Domain Size International Journal of Molecular Sciences, 23(7), 3502 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms23073502
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 году нами было продолжено исследование влияния фотопереключаемых липидов PhoDAG на свойства липидной мембраны и встроенных в нее каналов. Для исследования изменения толщины липидного бислоя при фотопереключении был проведен эксперимент по измерению электрической емкости липидной мембраны, сформированной методом Мюллера-Рудина. Было экспериментально показано, что ни емкость, ни проводимость мембраны практически не меняются при фотопереключении. Было проведено обширное теоретическое исследование формы мембраны, содержащей PhoDAG и другие мембранные включения, а также проанализирована методология вычисления толщины мембраны по ее емкости для случая неплоских, искривленных мембран. Общим выводом этих исследований является то, что толщина мембраны при фотопереключении меняется слабо, т.е. толщина, отнесенная к молекуле PhoDAG, соответствует толщине фонового липида и составляет 1,4-1,45 нм, спонтанная кривизна же слабо влияет на емкость мембраны, т.е. надежно определить ее из этих экспериментов нельзя.
Было проведено моделирование методами молекулярной динамики каналов MscS и MscL. Был реализован алгоритм молекулярного моделирования, включающий в себя построение модели азобензольного фрагмента PhoDAG методом полноатомного моделирования, построения крупнозернистой модели молекулы PhoDAG и моделирования системы из MscL и мембраны из 600 молекул DOPC в водном растворе NaCl. Изменение поведения канала наблюдалось по тому, как меняется площадь в его самом узком месте. Ввиду того, что открытие (даже частичное) канала является стохастическим процессом, за проведенное нами относительно небольшое количество симуляций оказалось невозможно достоверно определить эффект PhoDAGа на открытие каналов, однако проведение дополнительных симуляций по уже отработанному алгоритму позволит получить эти результаты в будущем.
Было проведено подробное теоретическое исследование того, как мембранные примеси, в частности, молекулы PhoDAG, в низкой концентрации влияют на время жизни проводящего состояния грамицидина А — пептида, который при обратимой трансмембранной димеризации формирует проводящий канал. Время жизни канала определяется величиной энергетического барьера при переходе из состояния димер в состояние пара — двух коаксиально расположенных мономеров. Наличие деформирующих мембрану включений изменяет энергии этих конфигураций и приводит к зависимости времени жизни от концентрации включений. Посредством кластерного разложения Майера статистической суммы по степеням концентраций мембранных включений были получены время жизни димера грамицидина и равновесное количество димеров в зависимости от поверхностной концентрации cis(trans)-PhoDAG, а также другого фотопереключаемого липида cis(trans)-OptoDArG. Показано, что логарифм относительного времени жизни линейно зависит от концентрации мембранных включений при их малой концентрации и определяется разностью майеровских интегралов взаимодействия димер-включение и пара-включение, соответственно. Вычисления проведены для случая двух фоновых липидов, DOPC и DPhPC, что позволяет, проведя два эксперимента, определить сразу два параметра PhoDAG — модуль изгиба и спонтанную кривизну. Помимо этого, теоретически предсказан нелинейный по концентрации режим зависимости времени жизни проводящего состояния грамицидина А для другого фотопереключаемого липида — OptoDArG.
Публикации
1. Калуцкий М.А,, Галимзянов Т.Р., Пинигин К.В. Determination of elastic properties of lipid membranes from simulation under varied external pressure PHYSICAL REVIEW E, Т. 107. – №. 2. – С. 024414. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1103/PhysRevE.107.024414
2. Кондрашов О.В., Акимов С.А. Alteration of Average Thickness of Lipid Bilayer by Membrane-Deforming Inclusions Biomolecules, 13(12), 1731 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/biom13121731
3. Кондрашов О.В., Акимов С.А. Поправки к электрической емкости деформированной липидной мембраны Биологические мембраны, - (год публикации - 2024)
Возможность практического использования результатов
не указано