Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Понять, как с точки зрения пространственной структуры устроено функционирование белков, задействованных в ключевых процессах жизнедеятельности клетки, является одной из ключевых задач современной биологии. Ее решение позволит более рационально разрабатывать лекарственные препараты против социально значимых заболеваний, действие которых, в том числе, направлено на мембранные белки и связанные с их функционированием каскады внутриклеточных реакций и межклеточное взаимодействие. Несмотря на важность изучения этих объектов, на данный момент всего лишь менее 10% известных структур в PDB относятся к мембранным белкам. Это связано со значительными сложностями, которые возникают при применении доступных на данный момент методов исследования этих объектов. Это относится как к биохимическому получению мембранных белков, так и к последующему исследованию их структуры. Бактериальный синтез в клетках E. coli, среди прочих, широко зарекомендовал себя как простой, эффективный и экономически выгодный способ продукции рекомбинантных белков, в том числе и мембранных. Однако зачастую, ввиду отсутствия адекватного аппарата для фолдинга эукариотических белков в бактериальных клетках, как и при бесклеточном синтезе, рекомбинантные мембранные белки накапливаются в составе телец включения или в нерастворимом виде. При этом продукт синтеза свернут неверно и для возможности проведения структурных исследований белка в нативной конформации остро встает вопрос о его эффективном рефолдинге. Один из вариантов - это полная денатурация полипептидной цепи жесткими детергентами и затем реконструкция в мембраноподобное окружение, пригодное для проведения структурных исследований. Однако в отсутствии отработанных схем рефолдинга мембранных белков это редко заканчивается успешно. При другом широко используемом подходе к ренатурации на первом этапе используют органические растворители, причем выбор часто падает на водную смесь трифторэтанола (ТФЭ), который стабилизирует трансмембранные альфа-спирали. Далее в присутствии органического растворителя происходит перевод в мембрано-подобное окружение, подходящее для структурных исследований. Часто в этой роли выступают липид/детергентные бицеллы, однако процесс их формирования в присутствии органического растворителя до сих пор детально не изучен. Данный Проект направлен на то, чтобы пролить свет на способы рационального рефолдинга мембранных белков. На текущем первом этапе исследования работы велись в нескольких направлениях и были направлены на разработку методик, позволяющих эффективно получать мембранные белки в нативной конформации для возможности их структурного изучения, в том числе с применением спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Во-первых, для поиска рационального способа рефолдинга спиральных мембранных белков из смеси вода / ТФЭ была получена информация об условиях формирования частиц липид/детергент для DMPC/CHAPS и DMPC/DHPC, в том числе в присутствии мембранных белков. Липидные агрегаты образуются при содержании воды 20-50%, а смешанные липид-детергентные частицы – при содержании воды свыше 60%. На примере TrkAtm было показано, что присутствие односпирального мембранного белка в смеси не нарушает выявленных закономерностей в процессе формирования частиц, причем TrkAtm встраивается в липид-детергентные комплексы при содержании воды в смеси свыше 50%. Во-вторых, для выполнения работ по Проекту были наработаны миллиграммовые количества пяти выбранных модельных объектов исследования, в том числе изотопно меченные стабильными изотопами 13С/15N. Часть из них, а именно TLR9tmjm, KvAp и TrkAtm, получали путем бесклеточного синтеза, а часть - p75-dECD и BR - при помощи бактериальной экспрессии в клетках E. coli. В-третьих, было изучено влияние различных детергентов и бицелл на эффективность ко-трансляционного встраивания, а также на выход функционально-активного мембранного белка при его продукции в бесклеточной системе диализного типа. В качестве модельного объекта использовали сенсорный родопсин Exiguobacterium sibiricum (ESR), поскольку этот белок обычно удается синтезировать с довольно высоким выходом в системах бесклеточного синтеза. При этом сравнительно просто оценивать эффективность его фолдинга, в том числе в присутствии мембраноподобного окружения, по наличию характерного пика поглощения правильно свернутого белка на длине волны 534 нм. В ходе выполнения работ по этому направлению была предложена схема проведения экспериментов по ко-трансляционному встраиванию, на языке программирования Python разработано программное обеспечение для пакетной обработки данных спектров поглощения с минимальными временными затратами. Уровень экспрессии и рефолдинга ESR был оценен при разных концентрациях и составах бицелл DMPC/CHAPS, DMPC/DHPC, DMPC/FacadeEM и мицелл детергентов CHAPS, DHPC, Facade EM в реакционной смеси, а так же в присутствии разных концентраций детергентов в питающей смеси. Выявлено, что наличие мембраноподобного окружения способствовало правильному сворачиванию целевого белка, однако, приводило к снижению суммарного накопления ESR в реакции. Присутствие в питающей среде соответствующего детергента в концентрации ККМ и выше повышало эффективность рефолдинга ESR. Весь план работ по проекту был выполнен в полном объеме. Все запланированные результаты были получены. Они являются уникальными, соответствуют мировому уровню исследований в данной области.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Определение пространственной структуры мембранных белков является исключительно важной задачей современной молекулярной биологии. Успехи в этом направлении неразрывно связаны, например, с возможностью применения рационального подхода к разработке лекарственных препаратов нового поколения, действие которых, в числе прочего, направлено на мембранные белки и связанные с ними каскады внутриклеточных реакций и межклеточных взаимодействий. В рамках Проекта велась разработка эффективных методов получения мембранных белков в нативной конформации для возможности их структурного исследования, в том числе с использованием спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Для этого работы на данном этапе велись по тем же двум направлениям, что и в первом отчетном периоде. Первое направление посвящено рефолдингу спиральных мембранных белков из водной смеси органического растворителя ТФЭ. В ходе работ по данному направлению разработана методика рационального рефолдинга мембранных белков из смесей органического растворителя трифторэтанол (ТФЭ)/вода в липид-детергентные бицеллы с последующим проведением оценки эффективности рефолдинга модельных объектов. Роль таких объектов выполняли полученные ранее миллиграммовые количества МБ: бактериородопсин (BR), трансмембранный фрагмент Толл-подобного рецептора 9 с примембранной областью (TLR9tmjm), вольт-сенсорный домен потенциалозависимого ионного канала KvAp (ВСД-KvAp), содержащий 4 спирали. Второе направление посвящено ко-трансляционному встраиванию мембранных белков в мембраноподобное окружение при их синтезе в бесклеточной системе диализного типа. Прежде всего были подобраны параметры документирования и найдены условия, при которых погрешность количественного определения выходов белка минимальна. Данные наработки могут быть использованы в будущем при работе с любыми другими белками, где необходимо делать оценку количества белка. На данном этапе разработанный подход позволил определить уровень синтеза общего и растворимого ESR с учетом уровня его активности, измеряемой по спектру поглощения на длине волны 534 нм, и провести оценку эффективности рефолдинга в различных условиях бесклеточного синтеза. В результате проведения скрининга различных мембраноподобных сред, включающий детергентные мицеллы, липид-детергентные бицеллы, липид-белковые нанодиски и липосомы, было показано, что для синтеза миллиграммовых количеств активного белка подходят бицеллы на основе детергентов из семейства Facade. При изучении влияния размера бицелл на основе детергентов Facade-EM, CHAPS и DHPC на уровень синтеза белка варьировали такой параметр, как q - соотношение липид:детергент (моль:моль). Показано, что оптимальным является диапазон значений от 1 до 3, при этом максимальный выход активного ESR в случае детергентов Facade-EM и CHAPS наблюдался при q=2. В случае DHPC - при q=1.5. При этом в случае бицелл CHAPS и DHPC активный белок накапливался примерно в одинаковом количестве, но в существенно меньшем, чем в случае Facade-EM. При изучении влияния концентрации Facade-EM в питающей среде на результат реакции бесклеточного синтеза, было отмечено, что когда концентрации детергента в реакционной и питающей смесях одинаковы, тогда уровень синтеза активного белка максимален (для бицелл с q=0.5 это 30 мМ Facade-EM в питающей смеси, для q=2 - это 7.5 мМ). При этом выход белка увеличивается на 20 %, поэтому, учитывая стоимость детергента, экономически может быть целесообразно использовать пониженные значения концентраций. Состав бицелл на основе Facade-EM так же влияет на уровень экспрессии общего, растворимого и активного ESR. Показано, что, во-первых, для формирования окружения, адекватно имитирующего мембрану, могут успешно использоваться различные типы липидов и их комбинации. Во-вторых, при наличии отрицательно заряженных липидов выход активного белка максимален, хотя оптимальные параметры бицелл при этом могут меняться. Так, например (для бицелл на основе Facade-EM) для DMPC и DMPC/40%DMPG максимальный выход активного белка был получен в бицеллах с q = 2, для DMPG и DLPC - для q=1, для POPC и DOPC - для q=0.5. Был проведен скрининг эффективности различных представителей семейства детергентов Facade и показано, что Facade-EM, Facade-TEM и Facade-EPC позволяют получать активный белок в растворимом виде в составе бицелл q = 2 при бесклеточном синтезе в количествах, сравнимых с выходами при использовании липид-белковых нанодисков. Эффективность разработанной методики ко-трансляционного встраивания в мембраноподобное окружение в процессе синтеза в бесклеточной системе показана на примере другого мембранного белка - фрагмента нейротрофинового рецептора p75 без внеклеточного региона, p75-dECD. Для этого был синтезирован изотопно-меченый вариант белка в присутствии бицелл DMPC:Facade-EM (q=2, 7.5 mM Facade-EM в питающей среде) и с использованием метода ЯМР показано, что внутриклеточный домен белка имеет правильную укладку. Таким образом, работы по всем направлениям, заявленным в плане работ на 2023 год, выполнены в полном объеме. По результатам работы в этом году опубликована вторая статья в рецензируемом научном журнале 1 квартиля.