Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Дегенеративные заболевания сетчатки и ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза человека являются одной из основных причин полной или частичной потери зрения. Наиболее распространённым и социально-значимым заболеванием является возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Существует предположение, что основным триггером развития ВМД является окислительный стресс различной природы [Abokyi et al., 2020; Ruan et al., 2021], однако до сих пор механизмы, приводящие к возникновению этой патологии, до конца не изучены. В механизмах старения и дегенерации сетчатки и РПЭ важнейшая роль принадлежит так называемому «пигменту старости» – липофусциновым гранулам (ЛГ), образующимся в клетках РПЭ в результате неполной лизосомальной деградации обломков фоторецепторов. При поглощении видимого света ЛГ способны генерировать активные формы кислорода (АФК), что определяет их фототоксичность [Boulton et al., 1993]. Бисретиноидные флуорофоры, входящие в состав ЛГ являются основным источником проявления фототоксичных свойств этим “пигментом старости”. Известно, что при поглощении света в присутствии кислорода бисретиноиды и сами могут окисляться. Недавно нами показано, что при ВМД наблюдается повышенное содержание окисленных форм бисретиноидов по сравнению с нормой. Было сделано предположение, что повышенное содержание окисленных форм бисретиноидов может быть биологическим маркером развития патологии даже в отсутствие клинической картины [Feldman et al., 2018]. Следует отметить, что механизмы фотоокисления бисретиноидов достаточно интенсивно изучаются. Однако остается неясным, каким образом АФК «нелипофусциновой» природы могут приводить к дегенерации сетчатки и РПЭ. А главное, каким образом можно определить, что окислительный стресс в таком случае негативно воздействовал на сетчатку и РПЭ? В первой части отчета представлены результаты исследований, в которых в качестве источника (модели) окислительного стресса использовано ионизирующее излучение (ИИ), воздействующее на глаза мышей. Известно, что при действии различных видов ИИ в клетках организма образуются АФК и развивается окислительный стресс, который может привести к гибели клетки [Kobashigawa et al., 2011]. В качестве модели были использованы мыши. Проведен сравнительный флуоресцентный и ВЭЖХ анализ ретиноидов и их окисленных форм в сетчатке и РПЭ мышей, облученных видимым светом, после воздействия ИИ и у контрольных животных. Были зарегистрированы спектры флуоресценции хлороформных экстрактов из сетчаток и РПЭ глаз мышей через сутки после экспериментов по воздействию на мышей ИИ. Анализ результатов показал, что наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции исследуемых хлороформных экстрактов из сетчаток и РПЭ в спектральной области 520-550 нм. Эти данные аналогичны ранее нами полученным результатам в подобном эксперименте [Yakovleva et al., 2022]. Другими словами, наблюдается радиационно-опосредованное окисление ретиноидов в клетках сетчатки и РПЭ. Сравнительный флуоресцентный и ВЭЖХ анализ хлороформных экстрактов, полученных через сутки в эксперименте по облучению мышей белым светом, показал практически полную идентичность результатам из экспериментов по воздействию ИИ. Таким образом, в данной работе мы подтвердили предположение о том, что радиационно-опосредованное окисление ретиноидов в клетках сетчатки и РПЭ глаза мыши аналогично фотоокислению ретиноидов. Таким образом, можно сделать вывод о том, что АФК любой природы, которые могут образовываться в клетках РПЭ и сетчатки способны окислять ретиноиды аналогично фотоокислению ретиноидов. Вторая часть работы была посвящена изучению физико-химических свойств окисленных форм бисретиноидов в ЛГ из РПЭ кадаверных глаз человека. Значимость этих исследований заключается в том, что совсем недавно нами были получены новые данные, указывающие на то, что окисленные формы бисретиноидов содержат активные альдегидные группы и обладают гидрофильными и амфифильными свойствами [Yakovleva et al., 2022]. Другими словами, окисленные бисретиноиды могут диффундировать из ЛГ в цитоплазматическую часть клетки РПЭ и оказывать токсическое воздействие на клеточные структуры уже в отсутствие света. Этот факт указывает на то, что окисленные формы бисретиноидов являются токсичными и в темновых условиях. Так в экспериментах in vitro мы показали, что эти соединения способны модифицировать белковые молекулы в отсутствие света [Dontsov et al., 2022]. Важным направлением в исследовании механизмов образования и физико-химических свойств окисленных форм бисретиноидов является изучение изменения химического профиля бисретиноидов, возникающее вследствие их фотоокисления. Для этого использовали три аналитических метода – Рамановскую и Фурье-ИК спектроскопии, а также масс-спектрометрию вторичных ионов (ToF-SIMS). Исследования проводили для двух объектов – синтетического флуорофора A2E (одного из наиболее изученных соединений в ЛГ) и хлороформных экстрактов из нативных и облученных видимым светом ЛГ. Методом масс-спектрометрии вторичных ионов (ToF-SIMS) показан достоверный рост карбонильных соединений в экстрактах из облученных ЛГ по сравнению с необлученными образцами. Аналогичный рост наблюдался и в продуктах фотоокисления бисретиноида А2Е. Эти результаты подтверждаются данными Рамановской и Фурье-ИК спектроскопии. Таким образом, выяснение молекулярных механизмов образования и проявления фототоксичности/токсичности ЛГ, использования этих знаний для определения стратегии профилактики и лечения глазных патологий, а также разработки новых неинвазивных методов их ранней диагностики является принципиально важным для современной фундаментальной и клинической офтальмологии. Итогом научно-исследовательской работы в рамках данного проекта стало написание и опубликование научных статей: 1. Feldman T.B., Dontsov A.E., Yakovleva M.A., Ostrovsky M.A. Photobiology of lipofuscin granules in the retinal pigment epithelium cells of the eye: norm, pathology, age. // Biophys. Rev. 2022, 14, 1051–1065. https://doi.org/10.1007/s12551-022-00989-9 2. M.A. Yakovleva, A.A. Vasin, A.E. Dontsov, A.A. Gulin, A.V. Aybush, T.B. Feldman, M.A. Ostrovsky. Physicochemical analysis of bisretinoid A2E photooxidative destruction products. // St. Petersburg Polytechnic University Journal: Physics and Mathematics. 2022, 15(3.2), 285-289. https://doi.org/10.18721/JPM.153.252 Цитируемые источники: Abokyi S. et al. // Oxidative Med. Cell. Longev. 2020, 2020, 7901270. Boulton M. et al. // J. Photochem. Photobiol. B Biol. 1993, 19, 201–204. Dontsov A. et al. // Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(3), 1534. Feldman T.B. et al. // EYE, 2018, 32, 1440–1448. Kobashigawa S., Suzuki K., Yamashita S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011, 414(4), 795–800. Ruan Y., Jiang S., Gericke A. // Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1296. Yakovleva M.A. et al. // Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(1), 222.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Дегенеративные заболевания сетчатки и ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза человека являются одной из основных причин полной или частичной потери зрения. Наиболее распространённым и социально-значимым заболеванием является возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Существует предположение, что основным триггером развития ВМД является окислительный стресс различной природы [Ruan et al., 2021], однако до сих пор механизмы, приводящие к возникновению этой патологии, до конца не изучены. В механизмах старения и дегенерации сетчатки и РПЭ важнейшая роль принадлежит так называемому «пигменту старости» – липофусциновым гранулам (ЛГ), образующимся в клетках РПЭ в результате неполной лизосомальной деградации обломков фоторецепторов. При поглощении видимого света ЛГ способны генерировать активные формы кислорода (АФК), что определяет их фототоксичность [Boulton et al., 1993]. Бисретиноиды, входящие в состав ЛГ являются основным источником проявления фототоксичных свойств этим “пигментом старости”. При поглощении света в присутствии кислорода бисретиноиды и сами могут окисляться. Недавно нами показано, что при ВМД наблюдается повышенное содержание окисленных форм бисретиноидов по сравнению с нормой. Было сделано предположение, что повышенное содержание окисленных форм бисретиноидов может быть биологическим маркером развития патологии даже в отсутствие клинической картины [Feldman et al., 2018]. На основе флуоресцентных свойств ЛГ разработан и широко внедрен в офтальмологическую практику неинвазивный диагностический метод аутофлуоресценции (АФ) глазного дна. Он позволяет оценить состояние сетчатки и РПЭ у пациентов, избрать тактику лечения и сделать прогноз в отношении развития нейродегенеративного заболевания [Holz et al., 2007]. В настоящее время предпринимаются попытки усовершенствования метода АФ глазного дна. Крайне перспективной является разработка метода детектирования времени жизни флуоресценции (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) [Schweitzer et al., 2012]). В экспериментах in vivo было показано, что результаты микроскопии методом FLIM для нормы и в случае ВМД различаются [Schweitzer et al., 2009]. Следует отметить, что до сих пор неизвестно, в результате чего возникает разница в характерных временах жизни флуоресценции для нормы и патологии. Ранее мы показали, что при ВМД содержание окисленных форм бисретиноидов ЛГ в клетках РПЭ выше по сравнению с нормой [Feldman et al., 2015; 2018]. Возможно, именно этот феномен и является причиной возникновения разницы в значениях характерных времен жизни флуоресценции между нормой и патологией при использовании метода FLIM. Для проверки такого предположения, нами были проведены эксперименты по определению времен жизни флуоресценции суспензии нативных ЛГ и фотоокисленных (модель ВМД). При помощи сканирующего конфокального микроскопа и системы время-коррелированного счета фотонов были зарегистрированы кинетики гибели флуоресценции исследуемых образцов. Полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что при увеличении содержания продуктов фотоокисления бисретиноидов в составе ЛГ происходит изменение параметров кинетических кривых затухания флуоресценции. Другими словами, мы предполагаем, что в случае ВМД при возбуждении флуоресценции длиной волны 515 нм, и ее регистрации на длине волны 580 нм будет наблюдаться увеличение среднего значения времени жизни флуоресценции по сравнению с нормой и увеличение вклада в суммарную флуоресценцию продуктов фотоокисления. Результаты сравнительного анализа времени жизни флуоресценции бисретиноидов и продуктов их фотоокисления позволяют заключить, что метод подсчёта коррелированных во времени фотонов может стать основой для дальнейшего усовершенствования метода FLIO (Fluorescence Lifetime Imaging Ophthalmoscopy (Sauer et al., 2018)) при ранней диагностике ВМД. В последнее время большое внимание уделяется изучению физико-химических свойств продуктов окисления бисретиноидов в ЛГ РПЭ [Feldman et al., 2022]. Предполагается, что эти продукты могут содержать альдегидные группы и обладать цитотоксичными свойствами. Однако нет достаточного доказательства того, что эти продукты являются карбонильными соединениями. Например, показано, что при действии АФК на фоторецепторные мембраны и РПЭ запускается процесс перекисного окисления липидов с образованием низкомолекулярных альдегидов и кетонов [Rózanowska et al., 2022], которые приводят к повреждению фоторецепторных клеток сетчатки и РПЭ и инициируют развитие дегенеративных процессов в структурах глаза. В рамках данного проекта методами комбинационного рассеяния, ИК-спектроскопии и времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов были проведены сравнительные исследования по обнаружению и идентификации соединений, содержащих карбонильные группы, в суспензии нативных ЛГ и облученных видимым светом (модель ВМД) и фотоокисленного синтетического А2Е, основного бисретиноида ЛГ. Сравнительный анализ результатов исследования показал, что для суспензии ЛГ и А2Е наблюдаются схожие тенденции в увеличении сигнала карбонильных полос 1750 1/см, 1450 1/см и 1350 1/см при фотоокислении образцов. Этот факт указывает на то, что в ЛГ детектируются продукты фотоокисления, содержащие альдегиды в свободном состоянии, аналогичные продуктам фотоокисления А2Е. Таким образом, показано, что продукты фотоокисления бисретиноидов в ЛГ содержат химически активные карбонильные группы. В рамках данного проекта были проведены эксперименты по исследованию цитотоксичных свойств окисленных бисретиноидов в темновых условиях с использованием клеточной культуры АРПЭ-19, нагруженной ЛГ. Для решения поставленной задачи были использованы методы определения жизнеспособности, МТТ-теста, ДНК-комет, флуоресцентного анализа, ВЭЖХ-анализа, иммуногистохимии. Сравнительный анализ образцов клеток РПЭ с нативными или предварительно облученными видимым светом ЛГ показал, что в обоих случаях в клетках РПЭ после темновой адаптации в течение 4-х суток запускается апоптоз. Он проходит как по митохондриальному, так и по каспазному пути, однако в случае предварительно облученных образцов с более высоким содержанием окисленных форм бисретиноидов этот процесс проходит заметно интенсивнее. При этом цитотоксический эффект от ЛГ имеет пролонгированное действие на клетки РПЭ. Кроме того, нативные неокисленные бисретиноиды ЛГ проявляют в основном фототоксический эффект, а уже окисленные бисретиноиды проявляют цитотоксическое действие на клетки РПЭ независимо от света. Таким образом, можно сделать вывод о том, что окисленные бисретиноиды оказывают цитотоксическое действие на клетку РПЭ в отсутствие света и могут рассматриваться как усугубляющий фактор прогрессирования ВМД. Итогом научно-исследовательской работы в рамках данного проекта стало написание и опубликование научной статьи: Яковлева М.А., Островский Д.С., Хубецова М.Х., Борзенок С.А., Фельдман Т.Б., Островский М.А. Изучение цитотоксичных свойств неокисленных и окисленных бисретиноидов липофусциновых гранул в клетках ретинального пигментного эпителия. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2023; 67(3): 76–87. Цитируемая литература: Boulton M. et al. // J. Photochem. Photobiol. B Biol. 1993, 19, 201–204. Ruan Y. et al. // Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1296. Feldman T.B. et al. // Anal. Bioanal. Chem. 2015. V. 407. P. 1075. Feldman T.B. et al. // Eye. 2018. V. 32. P. 1440 Feldman, T.B. et al. // Biophys. Rev. 2022. 14, 1051–1065. Holz F.G. et al. // Berlin-Heidelberg: Springer– Verlag, 2007. P. 342. Rózanowska, M.B.; Rózanowski, B. // Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 922. Sauer L. et al. // Invest. Ophthalmol. Visual Sci., 2018, 59, AMD65. Schweitzer D. et al. // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2012. V. 53. №. 7. P. 3376. Schweitzer D. et al. // Ophthal mology. 2009. V. 106. P. 714.