Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Исследованы подходы к синтезу целевых 3-гидроксиэстра-1,3,5(10)-триенов с функционализированной 17β-боковой цепью – как на основе 3-метоксистероидов, так и на основе 3-бензилоксистероидов. Выявлены основные недостатки схемы получения целевых стероидов методом одновременного деметилирования-восстановления 3-метоксистероидов диизобутилалюминий гидридом и предложен альтернативный вариант схемы синтеза с гидрогенолизом бензильной защиты фенольной группы стероида и последующим восстановлением карбонильной группы в боковой цепи. Разработаны методики синтеза производных 3-бензилоксиэстратриенов, в том числе содержащих циклопропановый 16α,17α-карбоцикл, и методики проведения конденсации 3-метокси- и 3-бензилокси-17-ацетилэстратриенов с ароматическими альдегидами. Получены продукты конденсации 17-ацетильных стероидов, содержащих и не содержащих дополнительные трех- и шестичленный 16α,17α-карбоцикл, с 4-N,N-диметиламинобензальдегидом, 4-бромбензальдегидом, 3,4-диметоксибензальдегидом, 4-трифторметилбензальдегидом, 4-цианобензальдегидом и пиридин-3-карбальдегидом. Для проведения последующих биологических исследований получен ряд целевых соединений – 3-гидрокси-17β-(1-гидрокси-3-(4-N,N-диметиламинофенил)пропил)эстра-1,3,5(10)-триенов с дополнительным 16α,17α-циклопропановым и циклогексановым карбоциклами и без него, 3-гидрокси-17β-(1-гидрокси-3-(3,4-дигидрооксифенил)пропил)эстра-1,3,5(10)-триенов с сопряженным 16α,17α-циклогексановым карбоциклом и без него. В ходе исследования методов наращивания 17β-боковой цепи изучаемых ключевых стероидов, показано, что алкилирование литиевых енолятов 17-ацетилэстратриенов приводит к образованию смесей продуктов полиалкилирования, соотношение между которыми зависит от стерических особенностей алкилируемой молекулы. Проведение реакции конденсации литиевых енолятов 17-ацетилстероидов и ароматических альдегидов в апротонной среде сопровождается рядом побочных окислительно-восстановительных процессов, аналогичных реакциям Оппенауэра / Мейервейна - Пондорфа – Верлея, что приводит к образованию стероидных 1,3-дикетонов наряду с целевыми продуктами конденсации Кляйзена-Шмидта – стероидными халконами (бензилиденостероидами).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В отчетный период были продолжены работы по расширению линейки целевых стероидов – 3-гидроксиэстратриенов с функционализированной 17-боковой цепью, содержащих и не содержащих дополнительные трех- и шестичленные 16,17-карбоциклы, а также проведены исследования антипролиферативной активности ряда синтезированных соединений в отношении двух клеточных линий рака молочной железы. Для соединений-лидеров, выявленных при исследовании антипролиферативной активности, было изучено их влияние на экспрессию ряда важных регуляторных и маркерных белков. При выполнении проекта была оптимизирована методика первой стадии синтеза – конденсации Кляйзена-Шмидта 3-метокси-17-ацетилэстра-1,3,5(10),16-тетраена и его производных с дополнительным трех- и шестичленным 16,17-карбоциклом с ароматическими и гетероароматическими альдегидами. Рассмотрение этой реакции как комплекса химических процессов, катализируемых основаниями, позволило улучшить воспроизводимость и повысить выходы продуктов конденсации малорастворимых стероидных субстратов. Кроме того, был осуществлен синтез 16,17-циклопропано- и –циклогексено-производных 3-бензилокси-17-ацетилэстра-1,3,5(10),16-тетраена и ряда продуктов их конденсации с ароматическими альдегидами. Показано, что метоксильные, диметиламино-, трифторметокси- и амидные группы в 17-боковой цепи продуктов конденсации Кляйзена-Шмидта (стероидные «халконы») выдерживают условия каталитического гидрирования в присутствии 10% палладия на угле как в случае 3-метоксистероидов, так и их 3-бензилоксианалогов. В последнем случае гидрирование сопровождается гидрогенолизом защитной бензильной группы 3-гидроксиэстратриенового стероида. В то же время цианофенильные и бромфенильные фрагменты в боковой цепи в этих условиях подвергаются гидрогенолизу. Подбором растворителя (этилацетат) или ингибитора гидрирования (пиридин) удалось снизить степень гидрогенолиза нитрильной группы производных 3-метоксистероидов, однако добиться селективного гидрогенолиза бензильной защиты 3-бензилоксистероидов при сохранении нитрильной группы в боковой цепи с использованием имеющейся каталитической системы оказалось невозможным. Предварительные исследования показали, что некаталитические методы восстановления двойных связей – ионное гидрирование (триэтилсилан-трифторуксусная кислота) пригодны для субстратов, не содержащих большого количества функциональных групп (3-метокси-17-циннамоилэстра-1,3,5(10),16-тетраен), однако для усложненного субстрата (стероидный «халкон» с морфолинометилфенильным фрагментом в боковой цепи) может оказаться предпочтительным использование борановых реагентов. Для получения стероидов, несущих в боковой цепи фрагмент сильноосновного амина, были разработаны методики синтеза N,N-дизамещенных 4-карбоксамидобензальдегидов и 4-N,N-диалкиламинометилбензальдегидов из 4-хлорметилбензойной кислоты на основе реакции бензилхлоридов с гексаметилентетрамином (реакция Соммле) и реакции восстановления амидов 4-аминометилбензойной кислоты диизобутилалюминийгидридом. Эти соединения, а также 3-цианобензальдегид, были использованы для синтеза целевых 3-гидрокси-17β-(1-гидрокси-3-(3-аминометилфенил)пропил)-16α,17α-циклогексаноэстра-1,3,5(10)-триена и 3-гидрокси-17β-(1-гидрокси-3-(4-морфолинометилфенил)пропил)-16α,17α-циклопропаноэстра-1,3,5(10)-триена. На примере ацилирования 3-гидрокси-17β-(1-гидрокси-3-(3-аминометилфенил)пропил)-16α,17α-циклогексаноэстра-1,3,5(10)-триена нитрофениловым эфиром N-трет-бутоксикарбонилглицина и янтарным ангидридом продемонстрирована возможность пост-синтетической модификации стероидных соединений с функционализированной 17-боковой цепью с целью дальнейшего построения на их основе сложных гибридных молекул и коньюгатов. Всего в ходе работы синтезировано 18 целевых 3-гидроксистероидов с функционализированной 17β-боковой цепью. Все соединения являются уникальными и нигде ранее не описаны. В течение второго года проекта получены данные об антипролиферативной активности 9 целевых соединений (3-гидроксистероидов с функционализированной боковой цепью) и 15 промежуточных продуктов (3-метокси- и 3-бензилоксистероиды с промежуточной «халконовой» боковой цепью), как содержащими, так и не содержащими дополнительные трех- или шестичленные 16,17-карбоциклы, в отношении эстрогензависимых клеток карциномы молочной железы MCF-7 (содержат рецептор эстрогенов) и высокоагрессивных трижды негативных клеток MDA-MB231 (не содержат рецептор эстрогенов, прогестерона и эпидермального фактора роста второго типа). Сопоставление данных антипролиферативной активности, полученных на двух типах клеток (MCF-7 и MDA-MB231), показывает, что цитотоксические эффекты стероидных «халконов» коррелируют с их высокой реакционной способностью как акцепторов Михаэля, при этом введение объемного дополнительного 16,17-карбоцикла снижает активность этих соединений, а существенных различий по типу клеток эти соединения не демонстрируют. Целевые же 3-гидроксистероиды показывают более выраженную активность в отношении ER(+) клеток MCF-7 (в среднем величины IC50 для клеток MCF-7 и MDA-MB231 различаются в 2 раза). Таким образом, можно предполагать, что антиэстрогенный потенциал 3-гидроксистероидов с функционализированной 17-боковой цепью вносит хотя и не исключительный, но значимый вклад в подавление роста раковых клеток. Среди проанализированных соединений были выделены два лидера – 3,4-дигидроксифенильный стероид V28 и морфолидофенильный стероид V92. Первый продемонстрировал высокую цитотоксичность и двухкратную разницу в активности для двух типов клеток (IC50 3.8 мкМ для MCF-7 и 7.4 мкМ для MDA-MB231), второй был менее активен, но более селективен в отношении ER(+)-клеток (IC50 13.4 мкМ для MCF-7 и > 50 мкМ для MDA-MB231). Цитотоксическая активность в отношении нормальных эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-10A, используемых в качестве модели для оценки нежелательных эффектов целевых соединений на здоровые ткани, была определена для соединения V28, величина IC50 составила 24.1 мкМ. Для лидерных стероидов V28 и V92 было исследовано их влияние на экспрессию ряда специфических белков (ERα, GREB1, cyclin D1, p-AKT/AKT, PARP и bcl-2) в клетках MCF-7 рака молочной железы методом иммуноблоттинга. Ведущий стероид V28 значительно ингибировал сигнальные пути ERα (ERα/GREB1), подавлял экспрессию регулятора клеточного цикла – циклина D1 – и индуцировал апоптоз, о чем свидетельствовало накопление расщепленного PARP и снижение экспрессии Bcl-2. Второй лидерный стероид V92 показал схожий профиль активности, но по сравнению с V28 оказался менее эффективным. Таким образом, стероид V28, несущий в функционализированной 17-боковой цепи 3,4-дигидроксифенильный фрагмент, является многообещающей основой для дальнейшей разработки противоопухолевых средств.