Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Разработаны методы синтеза функционализированных производных кабозантиниба на основе его гидроксильного производного, синтезированны карбоксилатные производные кабозантиниба, получены конъюгаты PROTAC, нацеленные на белок c-Met. Оптимизирован метод синтеза деметилированного производного мультикиназного ингибитора кабозантиниба 14 (схема 1), имеющего сайт конъюгации в положении «7» хинолинового фрагмента, модификация по которому не влияет на связывание с целевыми белками [Eur. J. Med. Chem., 2020, 192, 112174]. На основе соединения 14 были получены карбоксилатные производные кабозантиниба в качестве структурных блоков для синтеза целевых молекул типа PROTAC или SNIPER. С целью подобрать оптимальный линкер, длина и структура которого влияет на эффективность финальных молекул, была получено несколько серий молекул, различающихся структурами спейсеров. Были получены производные, содержащие простые алифатические линкеры (на основе алифатических карбоновых кислот) – соединения 16a, 16b, полярные линкеры на основе этиленгликоля и пропандиола-1,3 – соединения 18a, 18b, а также линкеры, содержащие в своем составе триазольный фрагмент на различном расстоянии от кабозантиниба – соединения 20a-d (схема 2). В качестве лигандов для Е3-лигаз были использованы производные леналидомида 22 (лиганд для белка CRBN) и пептидомиметика 21 (лиганд для белка VHL), синтез которых был осуществлен в ФГБНУ "НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе" согласно литературным методикам (схема 3). Ацилирование карбоновыми кислотами 26 и 27, имеющими на конце молекулы N-Boc-защищенную аминогруппу с дальнейшим удалением защитных групп позволило получить амины 23b, 24b и 25b, которые дальнейшем наряду с исходным VHL-лигандом 21, были сконъюгированы с полученными ранее карбоксильными производными кабозантиниба. В результате было получено 10 целевых молекул 28a-d, 29a-b, 30a-d (схема 4) и изучена их биологическая активность. 2. Изучена биологическая активность молекул PROTAC, нацеленных на белок c-Met. Оценка антипролиферативной активности синтезированных молекул 28a-d, 29a-b, 30a-d в сравнении с исходным кабозантинибом и его деметилированным производным 14, была проведена с использованием панели клеточных линий с различной экспрессией целевого белка c-Met (рис.1), наибольшее содержание которого наблюдалось в клетках линии HCC1954. Соединения серии 30, содержащие триазольный цикл, оказались неактивны вне зависимости от расстояния триазольного цикла от кабозантинибного фрагмента (таблица 2). Соединения 28а и 28с, содержащие линкеры на основе этиленгликоля и пропандиола соответственно, проявили наибольшую активность (IC50 у данных соединений на линии НСС1954 составил 5.7 и 6.7 µM соответственно), а конъюгаты 28b и 29а, также содержащие гликольный фрагмент, как и конъюгат 28d с неполярным линкером, были менее активны в отношении целевой клеточной линии. Таким образом, соединения 28а и 28с, обладающие наиболее оптимальным соотношением длины линкера и его полярности, были выбраны для определения способности индуцировать разложение целевого белка - c-Met, на клетках линии HCC1954. Методом иммуноблоттинга были изучены уровень фосфорилирования c-Met по аминокислотным остаткам Tyr1003 и Tyr1234/1235, а также изменение общего уровня белка (рис. 2), при этом была отмечена способность молекул 28а и 28с действовать как ингибиторы фосфорилирования c-Met в наномолярном диапазоне. При этом наблюдается дозозависимое снижение уровня c-Met: влияние выбранных соединений на уровень c-Met незначительно при наномолярных концентрациях, тогда как при низких микромолярных концентрациях наблюдается практически полное отсутствие фосфорилированных форм киназы и значительное снижение общего уровня белка. Таким образом, конъюгаты 28a и 28c подавляют фосфорилирование киназы c-Met в концентрациях ниже цитотоксических, что указывает на то, что утрата функций и убиквитинирование указанного белка является вероятной причиной гибели опухолевых клеток. Это позволяет использовать указанные молекулы в качестве стартовой платформы для оптимизации структуры с целью увеличения их активности как PROTAC-конъюгатов. 3. Синтезированы пептидомиметики – лиганды для апоптоз-ингибирующих белков Поскольку акцент в данном проекте сделан на использовании белков-ингибиторов апоптоза (IAP-белков) в качестве Е3-лигаз для протеасомального разложения онкомишененй, то было необходимо провести синтез лигандов для IAP-белков. В качестве лигандов для этих протеинов могут использоваться пептидомиметики, общая структура которых представлена на рисунке 3. Первым этапом в синтезе пептидомиметиков стала конденсация между 2-бромо-4’-гидроксиацетофеноном 35 и тиоамидом rac-33, приводящая к получению дизамещенного тиазола rac-38 (схема 5). Параллельно с этим проводили синтез дипептида N-метил-L-аланина и L-лейцина. Синтетическая последовательность представлена на схеме 6. Синтезированный в две стадии из L-аланина 39 N-Вос-N-метил-L-аланин 41 вводили в реакцию с метиловым эфиром гидрохлорида L-лейцина 43 в условиях пептидного синтеза. После гидролиза сложноэфирной группы был получен продукт 45, который далее использовали для конъюгирования с синтезированным ранее тиазолом rac-38 (схема 7). Проведение реакции пептидного синтеза с дальнейшим удалением защитных Boc- и MOM-групп позволило получить лиганд для IAP-белков 47 в виде смеси диастереомеров в соотношении 1 : 1. (схема 8). Для получения следующего IAP-лиганда было решено заменить остаток лейцина на изомерный ему трет.-лейцин и провести синтез соответствующего дипептидного структурного блока. Наряду со стандартным пептидным синтезом предложен метод получения IAP-лиганда с использованием четырехкомпонентной реакции Уги. Для нее синтезирован ключевой субстрат – изонитрил 53 исходя из трет.-лейцина. В настоящее время проводится оптимизация условий для четырехкомпонентной реакции Уги. 4. Синтезированы целевые конъюгаты SNIPER, нацеленные на киназу c-Met, изучена их биологическая активность. Синтез целевых конъюгатов SNIPER, нацеленных на киназу c-Met, был проведен с использованием синтезированного пептидомиметика 47 (полученного и используемого в виде смеси диастереомеров) и карбоксилатных производных кабозантиниба 18a, 18b. Синтез целевых молекул представлен на схеме 10 и протекал с применением реакций классического пептидного синтеза. В результате были получены первые агенты SNIPER 56 и 58 на основе кабозантиниба, нацеленные на разложение киназы c-Met. Соединения выделены в виде смесей диастереомеров в соотношении 1 : 1. На данном этапе было проведено определение антипролиферативной активности конъюгатов 56 и 58 в сравнении с IAP-лигандом 47, а также с интактным кабозантинибом и его деметилированным аналогом 14. Для эксперимента были использованы следующие клеточные линии A-431, T47D и HCC1954, результаты представлены в таблице 3. Установлено, что соединения 56 и 58 имеют схожую антипролиферативную активность, возрастающую с увеличением уровня экспрессии c-Met в выбранной клеточной линии. Это свидетельствует о том, что действие соединений связанно с нарушением функционирования целевой киназы. В то же время, активность IAP-лиганда 47 примерно одинакова по отношению ко всем выбранным клеточным линиям и не зависит от уровня экспрессии c-Met в выбранной клеточной линии. Таким образом, присутствие фрагмента IAP-лиганда в финальных конъюгатах 56 и 58 вносит одинаковый вклад в антипролиферативную активность по отношению ко всем выбранным клеточным линиям. 5. Принята к публикации статья по теме исследования: «Design, synthesis and in vitro investigation of cabozantinib-based PROTACs to target c-Met kinase» Anastasia A. Sachkova, Daria V. Andreeva, Alexander S. Tikhomirov, Alexander M. Scherbakov, Diana I. Salnikova, Danila V. Sorokin, Fedor B. Bogdanov, Yulia D. Rysina, Andrey E. Shchekotikhin, Ekaterina S. Shchegravina, Alexey Yu. Fedorov в журнале Pharmaceutics (Q1 SJR, IF = 6.525 (2021)), подтверждение о принятии к публикации и текст рукописи прилагаются.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1.5.1 Принята к печати статья А.А. Сачковой, Ю.Д. Рысиной, Е.В. Свирщевской, И.Д. Гришина, А.Ю. Федорова, Е.С. Щегравиной «Дизайн, синтез и in vitro антипролиферативная активность 4,5,6-тризамещенных 2-аминопиримидинов как потенциальных блокаторов сигнального каскада TGF-β». Журнал Органической Химии, 2024, письмо из редакции от 05.12.2023 о принятии статьи к публикации прилагается. 1.5.2 Синтезированы конъюгаты SNIPER, нацеленные на расщепление тирозинкиназ с-Met и VEGFR исходя из аминопроизводных IAP-лигандов и карбоксильных производных кабозантиниба. В качестве Е3-лигазы для данных конъюгатов SNIPER были предложены апоптоз-ингибирующие белки IAP. Синтез IAP-лигандов был проведен исходя из двух синтетических блока. Первый блок представлял собой дипептид, содержащий остаток N-Me-L-аланина и аминокислоты с объемным алифатическим заместителем. В качестве таких аминокислот нами были выбраны L-изолейцин (3), L-терт.-лейцин (4) и L-циклогексилглицин (5). Второй блок rac-13 был получен на основе пирролидина и арилзамещенного тиазола. Соединение двух блоков было реализовано по реакции пептидного синтеза. Было получено 4 лиганда в энантиомерно чистом виде и 2 лиганда в виде смеси диастереомеров. В качестве линкера для конъюгатов SNIPER выбраны спейсеры на основе пропандиола-1,3. На последнем этапе была проведена сборка целевых конъюгатов SNIPER исходя из производного кабозантиниба и IAP-лигандов в 3 стадии. Сначала проводилось присоединение линкера 19 к производному кабозантиниба 20, далее проводили замещение гидроксильной группы в соединении 21 на бром и на последней стадии было проведено алкилирование IAP-лиганда по фенольному фрагменту. Было получено 4 индивидуальных конъюгата SNIPER и один конъюгат в виде смеси диастереомеров. 1.5.3 Исследована биологическая активность полученных SNIPER, определена цитотоксическая активность, выявлены молекулы-лидеры для проведения дальнейших исследований. Для полученных IAP-лигандов, конъюгатов SNIPER, а также для кабозантиниба и его деметилированного производного была определена антипролиферативная активность. Она находилась в микромолярном диапазоне концентраций, однако IAP-лиганды оказались на 1.5-2 порядка менее токсичными, чем соответствующие им конъюгаты SNIPER. Было определено влияние самого активного из IAP-лигандов – соединения 16а на клеточный цикл на клетках НаСаТ. Соединение 16а достоверно увеличивает популяцию апоптотических клеток (37%) по сравнению с контролем (7%). Оценку способности конъюгатов SNIPER к расщеплению киназы c-Met проводили методом Western Blott. Показано, что конъюгат 25a существенно снижает количество белка c-Met в тестируемой концентрации (1 µМ), причем эффект, наблюдаемый в клетках HeLa, оказался более выраженным. 1.5.4 Осуществлен синтез новых потенциальных ингибиторов TGFβR1 (ALK5) на основе дизамещенных 1,3-оксазинов или 1,3-тиазинов На основании литературных данных нами был предложен новый структурный тип потенциальных ингибиторов TGFβR1 на основе 4,5,6-тризамещенных 2-аминопиримидинов. Вначале был протестирован метод, основанный на проведении трехкомпонентной реакции гетеро-Дильса-Альдера. Данные подход не привел к положительным результатам. Следующий подход базировался на трехкомпонентной реакции по типу Бигинелли. Установлено, что оптимальным является проведение реакции в присутствии NaOH в среде ТГФ с добавлением в реакционную смесь на завершающем этапе окислителя 2,3-дихлоро-5,6-дициано-1,4-бензохинона (DDQ). Данная система была выбрана для получения ряда 4,5,6-тризамещенных 2-аминопиримидинов (32-40), было получено 9 новых производных с выходами 15-67%. Поскольку использование DDQ ограничивает круг возможных субстратов соединениями, нами был разработан третий подход к синтезу дигидропиримидинов, позволяющий расширить ряд целевых производных. Он заключался в проведении реакции Бигинелли между п-метоксибензальдегидом, ацетофеноном и гуанидином в присутствии избытка КОН, что приводило к 2-аминопиримидину 43, бромированию его по положению «5» с образованием продукта 44 и внедрению гетероциклического фрагмента по реакции кросс-сочетания Сузуки. С использованием данного подхода было получено 5 новых производных 45-49 с выходами 35-99%. Для определения возможности использования аминогруппы в положении «2» пиримидинового кольца в качестве сайта конъюгации были синтезированы ацилированное и алкилированное производные 2-аминопиримидина 45. Помимо производных 2-аминопиримидина, нам удалось получить производные пиримидин-2(1Н)-она 52 и производные пиримидин-2(1Н)-тиона 53 по реакции кетона 31 и бензальдегида 26 с мочевиной и тиомочевиной, соответственно. 1.5.5 Определена биологическая активность in vitro полученных 4,5,6-тризамещенных 2-аминопиримидинов. Для полученных 2-аминопиримидинов 32-40, 45-51 была проведена оценка антипролиферативной активности методом МТТ. Антипролиферативная активность всех исследуемых соединений находится в диапазоне 6-200 µМ. Наиболее чувствительной оказалась линия К562. Пиримидины, содержащие п-метоксифенильный заместитель, являются более активными, чем остальные производные. Замена фенильного кольца на трет.-бутильную группу не оказала влияния на активность молекул. Важным является сохранение активности соединений при проведении ацилирования и алкилирования по аминогруппе, поскольку это позволяет создавать конъюгаты на основе указанных молекул, используя данный сайт функционализации. 1.5.6 Проведён синтез конъюгатов SNIPER на основе наиболее активных 2-аминопиримидинов – потенциальных ингибиторов киназы TGFβR1. На основе отобранного на предыдущем этапе аминопиримидина 34 были получены целевые молекулы SNIPER. В качестве сайта связывания была выбрана аминогруппа в положении «2» пиримидинового кольца. Для введения линкера была использована реакция аза-Михаэля между трет.-бутилакрилатом и исходным аминопиримидином 34. Желаемый продукт 54 был получен с выходом 44% при проведении реакции без растворителя с 10-ти кратным избытком трет.-бутилакрилата при 110 °С в присутствии AlCl3. Дальнейшее восстановление в присутствии LiAlH4 и галогенирование позволило получить бромпроизводное 56 для участия в финальной реакции алкилирования с лигандом для IAP-белков 16а. Целевой конъюгат SNIPER 57 был получен с выходом 75%. Аналогичным образом было получено целевое соединение 61 с более длинным линкером.