КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 22-23-00559

НазваниеГибридные биоматриксы с интеллектуальным антибактериальным покрытием на основе ксеноперикарда Bos taurus и наночастиц хитозана для сердечно-сосудистой хирургии

РуководительЧащин Иван Сергеевич, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2022 г. - 2023 г. 

Конкурс№64 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-302 - Структура и свойства полимеров, многокомпонентных полимерных систем

Ключевые словахитозан, угольная кислота, бифазная система вода/диоксид углерода, высокие давления, клатратные гидраты, полимерные наночастицы, ванкомицин, фторхинолин, глутаровый альдегид, перикард, гибридные биоматриксы, интеллектуальный отклик, биопротезы.

Код ГРНТИ34.57.21


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В последние десятилетия наблюдается повышенный интерес к разработке новых композиционных биоматериалов для создания биопротезов с существенно увеличенным сроком службы. В настоящей момент, проблема устранения кальциноза биологических протезов клапанов сердца и послеоперационных инфекционных осложнений является важной научно-практической задачей, решением которой может стать создание гибридного биоматрикса на основе стабилизированной глутаровым альдегидом (ГА-сшитой) ксеноткани перикарда с биополимерным покрытием. Интерес к биополимерам, в том числе и в области создания гибридных биоматриксов, в значительной степени связан с их природной возобновляемостью, биосовместимостью, а также антимикробным свойствам. В настоящем проекте планируется с использованием «зеленых технологий», а также биосовместимых природных полимерных материалов разработать новые подходы к созданию биопротезов для кардиохирургии, отличающихся от ныне существующих лучшей функциональностью и более длительным сроком службы. Из анализа литературы, а также работ нашего коллектива следует, что наиболее подходящим по предъявляемым функциональным характеристикам, к тому же, биосовместимым с коллагеновой тканью искусственных клапанов сердца является хитозан. К тому же, его растворимость в воде и высокая проникающая способность при сверхкритическом давлении СО2, должна обеспечить импрегнирование и надежное конформационное закрепление полимера во внутренние полости пористой коллагеновой матрицы. Особенностью создаваемого антибактериального покрытия является то, что оно будет состоять из наночастиц хитозана, инкапсулированных антимикробными агентами, и закрепленных на биоматриксе из перикарда быка (Bos taurus). В качестве антибактериальных агентов будет использован высокоэффективный антибиотик четвертого поколения ванкомицин, не подвергаемый деструкции в физиологических условиях на протяжении длительного времени тетрациклин, а также устойчивые в различных средах производные фторхинолинового ряда. Такое строение данного покрытия позволяет реализовывать эффект интеллектуального антимикробного отклика на рост патогенной биоплёнки за счёт расправления полимерных хитозановых цепей на короне хитозановых наночастиц при понижении рН в результате протонирования полимерных цепей и электростатического отталкивания заряженных аминогрупп, что приведет к: 1) возрастанию площади полимерной короны, 2) высвобождению антимикробного агента, инкапсулированного в наночастицу. При этом, антибактериальные вещества при нормальном функционировании организма инкапсулированы в биосовместимую хитозановую оболочку, могут выделятся лишь при контакте патогенных бактерий с биопротезом. Кроме того, ожидается высокая стабильность покрытия из хитозановых наночастиц за счёт ковалентного связывания аминогрупп полимера с остаточными альдегидными группами на поверхности ГА-сшитой коллагеновой ксеноткани. Наличие люминисценции в УФ-свете при длине волны 365 нм у входящего в состав наночастиц антибактериального фторхинолина, позволяет осуществлять анализ качества хитозанового покрытия при помощи OLED-технологий. Особая роль в проекте будет уделена фундаментальным исследованиям влияния физического растворителя хитозана системы H2O/CO2 на структуру и свойства формируемых полимерных наночастиц и биополимерных покрытий на их основе. Будет впервые всесторонне исследовано влияние давления (P) и рН в бифазной системе вода/диоксид углерода (в том числе исследовано влияние среды флуктуирующей фазы клатратных гидратов) на характеристики получаемых в этих растворах наночастиц (степень набухания наночастиц, ζ-потенциал, степень сшивки, растворимость в растворах бифазной системы). В рамках реализации проекта будут исследованы закономерности формирования гибридных биоматриксов с хитозановым покрытием, подобраны оптимальные условия нанесения покрытия из бифазной системы (температура, давление СО2, время экспозиции), а также исследованы свойства покрытия (гидрофильность, характер связи с матриксом, физическое состояние). Это будет первым известным из литературы примером создания таких гибридных биоматриксов с использованием в качестве растворителя воды, насыщенной СО2 под высоким давлением. Будут всесторонне исследованы механико - прочностные и биологические свойства (способность к подавлению кальциноза, антимикробность и биосовместимость) получаемых биоматриксов при оптимальных параметрах, давления, температур и времени экспозиции. Для изучения биологических свойств и устойчивости покрытий к кальцинозу планируется проведение ряда модельных in vivo исследований на мелких лабораторных животных. Устойчивость к микробной колонизации, а также интеллектуальный антимикробный отклик будут исследован в опытах по заселению матриц с биополимерными покрытиями и контрольных образцов биоткани музейными и клиническими штаммами микроорганизмов при различных значения рН, моделирующих нормальное состояние и инфекционное заражение имплантата.

Ожидаемые результаты
1. В рамках реализации проекта будут разработаны основы методов создания биокомпозитных матриксов на основе ГА-сшитой коллагеновой ксеноткани с наноструктурированным хитозановым покрытием с инкапсулированными лекарственными веществами (антибиотиками - ванкомицин, тетрациклин, новые специально синтезированные соединения фторхинолинового ряда). Впервые в качестве среды, в которой происходит формирование таких композитов будет бифазная системы H2O/CO2. 2. Впервые с помощью меченого тритием хитозана будет исследована кинетика и изотермы адсорбции наночастиц хитозана, нанесённых на коллагеновую ткань из растворов системы H2O/CO2 под давлением. 3. Впервые будет исследована общие закономерности формирования наночастиц хитозана и наноструктурированных покрытий на их основе при нанесении из растворов в угольной кислоте и влияние на их морфологию и структуру условий их получения, в частности, будет оценено влияние параметров среды (температура, давление, pH, ионная сила). 4. Будут исследованы характер взаимодействия формируемого покрытия на основе наночастиц хитозана с ГА-стабилизированной коллагеновой матрицей перикарда, а также гидрофильные свойства покрытия и его физическое состояние в биоматриксе. 5. Впервые будет систематически исследовано влияние среды клатратных гидратов в бифазной системе вода/диоксид углерода на структуру коллагенового биоматрикса с покрытием на основе наночастиц хитозана. Особенностью данной фазы является то, что при определённых параметрах давления и температур бифазная система вода/диоксид углерода будет переходит в однородную фазу клатратных гидратов, способных, как было ранее нами показано, задавать нано- и микропористую гистоархитектонику коллагенового матрикса за счёт "бомбардировки" флуктуирующих клатратных гидратов. 6. На модельных in vivo экспериментах будет исследована стабильность биополимерного покрытия, наносимого на коллагеновые матрицы из растворов в угольной кислоте, при варьировании давления и рН угольной кислоты. Будет исследован механизм интеллектуального антимикробного отклика в опытах по заселению матриц с биополимерными покрытиями и контрольных образцов биоткани музейными и клиническими штаммами микроорганизмов при различных значения рН, моделирующих нормальное состояние и инфекционное заражение имплантата. 7. Ожидается, что полученные в результате реализации проекта научные результаты могут быть успешно применены для создания нового поколения гибридных биоматриксов с индуцированным высвобождением гормональных препаратов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Прочное антимикробное защитное покрытие биоматриксов значительно повышает функциональность медицинских устройств, в частности биопротезов. В нашей работе мы получили специальное покрытие на основе наночастиц хитозана (в том числе допированных наночастицами Ag, а также впервые синтезированным антибиотиком), которые были получены и нанесены с использованием биосовместимой и самонейтрализующейся угольной кислоты в качестве полимерного растворителя. Такой подход позволяет получить биоматрицу с ковалентно связанным полимерным экраном с наночастицами, которые, в свою очередь, могут быть допированы (загружены) антимикробными агентами. Для цели создания хитозановых наночастиц допированных новым антибиотиком, впервые был получен композит на основе хитозана и синтезированного соединения фторхинолинового ряда 5-диметиламинометил-7-(2,2,2-трифтор-1-гидрокси-1-трифторметил-этил)-хинолин-8-ола (АФОХ). Проведен сравнительный анализ его антимикробной активности с другими хитозановыми композитами, содержащими в своем составе широко применяемые в современной медицине антибиотики тетрациклин, ванкомицин, ципрофлоксацин. Показана эффективность нового композита в плане подавления роста S.Aureus, что полагает также возможность получения хитозановых наночастиц допированных АФОХ для применения их в качестве покрытия биопротезов клапанов сердца, в том числе, с применением угольной кислоты. Впервые было показано, что в растворах в угольной кислоте методом ионного гелирования можно получать стабильные наночастицы хитозана. Были выявлены оптимальные параметры с точки зрения получения стабильных и однородных по размеру наночастиц в угольной кислоте: применение низкомолекулярного хитозана (Mη<100 кДа) , соотношение сшивателя (триполифосфата) к полимеру – 1:6, давление в угольной кислоте – 10-30 МПа. Было установлено, что в растворах хитозана в угольной кислоте, при найденных оптимальных условиях получения наночастиц, можно формировать устойчивые наночастицы хитозана допированные антибиотиком (АФОХ) и наночастицами серебра с высоким значением дзета-потенциала (|ζ|=45±5 и 35±5 мВ соответственно). Более того, высокоточный анализ, с использованием метода радиоактивных индикаторов, показывает четырехкратное увеличение осаждения наночастиц полимера, допированных наночастицами серебра, по сравнению с осаждением из обычного растворителя. Используя микроскопию высокого разрешения, удалось идентифицировать ультратонкое покрытие из полимерных сферических наночастиц (~50 нм для частиц допированнных Ag и ~70 нм, для допированных АФОХ), прилипающих к коллагеновым фибриллам. ИК НПВО анализ поверхности гибридного матрикса показал ковалентное связывание покрытия с исходным матриксом на основе сшитого глутаровым альдегидом перикарда, а исследование структуры объёма матрикса с помощью микроскопии высокого разрешения ультратонких срезов, показывает внедрение покрытия в поры исходного матрикса и сохранение гистоархитектоники ткани перикарда после нанесения. Результаты антимикробных исследований, а именно способности покрытия подавлять адгезию и рост патогенных бактерий, показывают возможность реализации индуцированного антимикробного ответа за счет изменения набухания полимерных наночастиц и высвобождения антимикробных агентов в случае роста патогена на биопротезе. Было получены весьма обнадёживающие результаты для гибридного матрикса с покрытием из наночастиц хитозана, допированных наночастицами серебра, в плане подавления кальциноза. Оказалось, что такой гибридный матрикс с покрытием содержит только (0,015±0,005) мас.% солей кальция после 4-месячного эксперимента на модельных крысах in vivo, что примерно на порядок ниже, чем, для применяемого в настоящий момент золотого стандарта в кардиохиругии - сшитого глутаровым альдегидом перикарда (0,070±0,015) мас.%.

 

Публикации

1. Чащин И. С., Синолиц М. А., Бадун Г. А., Чернагшева М. Г., Анучина Н. М., Крашенинников С. В., Хугаев Г. А., Петленко А. А., Бритиков Д. В., Зубко А. В., Курилов А. Д., Дрегер Е. И., Бакулева Н. П. Chitosan/hyaluronic acid polyanion bilayer applied from carbon acid as an advanced coating with intelligent antimicrobial properties for improved biological prosthetic heart valves International Journal of Biological Macromolecules, - (год публикации - 2022)

2. Чащин И.С., Перепёлкин Е.И., Дяченко В.И. Изучение антимикробного действия хитозанового покрытия, допированного фторсодержащими хинолинами Высокомолекулярные соединения (Polymer Science), - (год публикации - 2023)

3. Чащин И.С., Перепелкин Е.И., Синолиц М.А.,Бадун Г.А., Чернышева М.Г. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ АДСОРБЦИИ НАНОЧАСТИЦ ХИТОЗАНА НА БИОМАТРИКСЫ ИЗ РАСТВОРОВ В УГОЛЬНОЙ КИСЛОТЕ X Российская конференция с международным участием «Радиохимия-2022», X Российская конференция с международным участием «Радиохимия-2022», Сборник тезисов, стр.536 (год публикации - 2022)


Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения второго этапа проекта были исследованы фундаментальные закономерности формирования покрытий на основе наночастиц хитозана, сформированных и нанесённых на модельные подложки и коллагеновую ткань биологических протезов с применением растворов угольной кислоты под давлением. Дополнительно, была изучена возможность получения в растворах угольной кислоты, а также стабильность комплексов хитозана с новыми, впервые синтезированными фторсодержащими соединениями. Синтезированные фторсодержащие хинолины являются альтернативой широко применяемых в медицине антибиотиков таких как ванкомицин, тетрациклин, ципрофлоксацин. В рамках исследований, связанных с новыми синтезированными фторсодержащими хинолинами, были найдены условия получения устойчивых комплексов хитозана с этими соединениями. Установлено, что в растворах угольной кислоты (в бифазной системе Н2О/СО2 под давлением) при давлениях Р=30-50 МПа и температурах T=23-30 ºС лучше всего растворим АФОХ (5-диметиламинометил-7-(2,2,2-трифтор-1-гидрокси-1-трифторметил-этил)-8-оксихинолин). АФОХ формирует с хитозаном в растворе угольной кислоты прозрачный раствор зелено-желтого оттенка и имеет наибольшую среди синтезированных фторхинолинов интенсивность пика на длине волны 254 нм. Установлено, что комплекс с хитозаном НФОХ (7-(1-гидрокси-1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)-5-нитро-8-оксихинолин) при найденных условиях растворим хуже, и имеет меньший пик по интенсивности на длине волны 257 нм, ну и, наконец, ФОХ (5,7-ди-(1-гидрокси-1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)-8-оксихинолин), плохо растворим, что подтверждается слабым сигналом на 251 нм и осадком в растворе. Была изучена стабильность комплексов хитозана с широко применяемыми антибиотиками. Оказалось, что наибольшую стабильность, после длительной экспозиции (больше года), демонстрируют комплексы хитозана с АФОХ и ципрофлоксацином, которая обеспечивается за счёт образования многочисленных водородных связей в комплексе и надежной фиксацией с макромолекулами хитозана. В свою очередь, тетрациклин и ванкомицин деградируют, что выражается в зашкаливающем сигнале УФ-спектра растворов таких комплексов с хитозаном. Было обнаружено, что при нанесении наночастиц хитозана (сформированных в растворах угольной кислоты методом ионного гелирования) из растворов угольной кислоты, с возрастающей концентрацией полимерных наночастиц, происходит самоорганизация наночастиц в «нити», образующих единую связанную сетку в некоторых областях подложки. Можно предположить, что при дальнейшем повышении концентрации покрытие, сформированное нанесением из раствора угольной кислоты составных наночастиц, будет однородное по толщине с высокой степенью взаимных зацеплений частиц друг с другом, что должно благоприятно сказаться на механической стабильности покрытия. Действительно, исследование влияния некоторых параметров нанесения (давление и длительность экспозиции) составных наночастиц хитозана, допированных наночастицами серебра (ХТЗ_Ag/ТПП), из растворов в угольной кислоте на матрицы перикарда из растворов в угольной кислоте показывают усиление прочности биоматериала (Δσ на ⁓40% больше, чем для контрольного) с сохранением эластичности при давлении Р=30 МПа и времени экспозиции 3-6 часов. Был доказан факт изменения конформации составных наночастиц и усиление высвобождения лекарственных средств из них при условиях, моделирующих инфекционное заражение биопротеза. С помощью метода АСМ было установлено, что составные наночастицы ХТЗ_Ag/ТПП полученные в угольной кислоте и нанесённые на модельную подложку существенно изменяют свой диаметр при понижении рН среды с значения 7,4 до 5,0. Оказалось, что частицы при понижении рН увеличивается в размере в среднем с (20±5) нм для рН=7,4, до (75±20) нм для рН=5,0. Исходя из полученных результатов по структурному переходу наночастиц при понижении рН, можно предположить, что при инфекционном заражении, в результате расправления полимерной оболочки составной наночастицы, будет наблюдаться усиленное высвобождение лекарственного вещества. С помощью высокоточного метода радиоактивных индикаторов, на модельном эксперименте с раствором наночастиц хитозана допированных ванкомицином и полученных методом ионного гелирования в растворах угольной кислоты (ХТЗ_Ванк/ТПП) были проведены исследования закономерностей высвобождения лекарства (ванкомицина). При моделировании инфекционного заражения (pH раствора с наночастицами – 5,0) и нормальных физиологических условий (рН раствора 7,4) было установлено, что при нормальном pH в течение получаса происходит высвобождение некоторой доли, слабо инкапсулированного в полимерную оболочку наночастиц, ванкомицина (около 15 % от общего количества допированного антибиотика), затем в течение трёх суток выходит ещё 10 % и кривая высвобождения ванкомицина выходит на плато. В случае имитации роста патогенной биоплёнки, в первые полчаса высвобождается 25 % от общего количества допированного лекарства и еще 12 % в течение трёх суток. Следовательно, можно говорить о том, что при инфекционном заражении импланта количество высвобождающегося ванкомицина увеличивается на 15 %, по сравнению с нормальным состоянием. Кроме того, стоит отметить, что ванкомицин из полимерной матрицы десорбируется не полностью, таким образом, можно предположить, что при повторных заражения можно ожидать эффективный антимикробный ответ. Таким образом, выявленные закономерности высвобождения антибиотика из наночастиц хорошо согласуется с модельными экспериментами по исследовании кислотности среды на конформацию адсорбированных наночастиц хитозана. Было обнаружено, что покрытие на основе наночастиц ХТЗ_Ванк/ТПП полностью подавляет адгезию и дальнейший рост бактерий S. Aureus на биоматрице (выживаемость), в то время как тестируемый образец коллагена без покрытия очень хорошо адгезирует патогены на поверхности и не ингибирует их дальнейший рост. Была исследована стабильность получаемого покрытия на основе наночастиц ХТЗ_Ванк/ТПП с помощью модельного in vivo эксперимента на крысах, в ходе которого животным были имплантированы матрицы ГА-перикарда с покрытием на 4 месяца. Было установлено, что количество хитозана в результате биорезорбции снижается до 30-35 % от исходного ((1,05±0,05) вес.%) после 4 месяцев нахождения в крысах. Такое количество хитозана вполне достаточно для маскирования остаточных альдегидных групп на поверхности перикарда и ингибирования развития кальциноза. С другой стороны, впервые было выявлено, что ванкомицина исходно адсорбируется на матрикс (0,16±0,03) вес.%, а остается после эксперимента – (0,08±0,02) вес.%. Таким образом, соотношение антибиотик/хитозан выросло после опыта– было (15±3) %, стало (30±10) %, р<0,005. Такое изменение соотношения антибиотик/хитозан является косвенным доказательством того, что ванкомицин допирован («закручен») в полимерные частицы. Таким образом, удалось установить, что покрытие на основе наночастиц хитозана, допированных ванкомицином, полученных в угольной кислоте, а также нанесенных на коллагеновые матрицы ГА-перикарда из растворов в угольной кислоте устойчиво к биорезорбции. Полученные результаты позволяют ожидать сохранение устойчивости биоимплантата с новым покрытием ХТЗ_Ванк/ТПП в плане подавления кальциноза и микробного заражения коллагеновой матрицы и, соответственно, потенциально долгую работу биопротеза. Наконец, была доказана биосовместимость биоматриксов с покрытием на основе наночастиц хитозана, полученным в растворах угольной кислоты. Исследование цитотоксичности биоимплантов показало, что образцы с новым покрытием на основе наночастиц наночастиц хитозана, не только является биосовместимыми, но и, более того, способствует увеличению пролиферации клеток, то есть являются перспективными с точки зрения создания самообновляющихся биоимплантатов.

 

Публикации

1. В.И. Дяченко, С.М. Игумнов THE REACTION OF POLYFLUOROKETONES WITH DIMECARBIDE – A NEW APPROACH TO 6-FLUOROALKYLMODIFICATION OF 5-HYDROXYINDOLES Fluorine notes, Online journal “Fluorine notes” ISSN 2071-4807, Vol. 5(150), 2023; DOI: 10.17677/fn20714807.2023.05.03 (год публикации - 2023) https://doi.org/0.17677/fn20714807.2023.05.03

2. Евгений И. Перепелкин, Мария А. Синолиц, Геннадий А. Бадун, Мария Г. Чернышева, Неля М. Анучина, Сергей С. Абрамчук, Эдуард Э. Левин, Наталья П. Бакулева, Дмитрий А. Попов, Иван С. Чащин Composite chitosan-based nanoparticles as a basis for innovative antimicrobial coating for bioprosthesis: Preparation and application using carbonic acid as a “green” self-neutralizing solvent European Polymer Journal, Volume 193, 19 July 2023, 112104 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.eurpolymj.2023.112104

3. И.С. Чащин, Е.И. Перепёлкин, В.И. Дяченко Study of the Antimicrobial Action of Chitosan Coating Doped with Fluorinated Quinolines olymer Science, Series B,, Vol. 65, No. 3, pp. 307–318 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1134/S1560090423700847


Возможность практического использования результатов
не указано