Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Прочное антимикробное защитное покрытие биоматриксов значительно повышает функциональность медицинских устройств, в частности биопротезов. В нашей работе мы получили специальное покрытие на основе наночастиц хитозана (в том числе допированных наночастицами Ag, а также впервые синтезированным антибиотиком), которые были получены и нанесены с использованием биосовместимой и самонейтрализующейся угольной кислоты в качестве полимерного растворителя. Такой подход позволяет получить биоматрицу с ковалентно связанным полимерным экраном с наночастицами, которые, в свою очередь, могут быть допированы (загружены) антимикробными агентами. Для цели создания хитозановых наночастиц допированных новым антибиотиком, впервые был получен композит на основе хитозана и синтезированного соединения фторхинолинового ряда 5-диметиламинометил-7-(2,2,2-трифтор-1-гидрокси-1-трифторметил-этил)-хинолин-8-ола (АФОХ). Проведен сравнительный анализ его антимикробной активности с другими хитозановыми композитами, содержащими в своем составе широко применяемые в современной медицине антибиотики тетрациклин, ванкомицин, ципрофлоксацин. Показана эффективность нового композита в плане подавления роста S.Aureus, что полагает также возможность получения хитозановых наночастиц допированных АФОХ для применения их в качестве покрытия биопротезов клапанов сердца, в том числе, с применением угольной кислоты. Впервые было показано, что в растворах в угольной кислоте методом ионного гелирования можно получать стабильные наночастицы хитозана. Были выявлены оптимальные параметры с точки зрения получения стабильных и однородных по размеру наночастиц в угольной кислоте: применение низкомолекулярного хитозана (Mη<100 кДа) , соотношение сшивателя (триполифосфата) к полимеру – 1:6, давление в угольной кислоте – 10-30 МПа. Было установлено, что в растворах хитозана в угольной кислоте, при найденных оптимальных условиях получения наночастиц, можно формировать устойчивые наночастицы хитозана допированные антибиотиком (АФОХ) и наночастицами серебра с высоким значением дзета-потенциала (|ζ|=45±5 и 35±5 мВ соответственно). Более того, высокоточный анализ, с использованием метода радиоактивных индикаторов, показывает четырехкратное увеличение осаждения наночастиц полимера, допированных наночастицами серебра, по сравнению с осаждением из обычного растворителя. Используя микроскопию высокого разрешения, удалось идентифицировать ультратонкое покрытие из полимерных сферических наночастиц (~50 нм для частиц допированнных Ag и ~70 нм, для допированных АФОХ), прилипающих к коллагеновым фибриллам. ИК НПВО анализ поверхности гибридного матрикса показал ковалентное связывание покрытия с исходным матриксом на основе сшитого глутаровым альдегидом перикарда, а исследование структуры объёма матрикса с помощью микроскопии высокого разрешения ультратонких срезов, показывает внедрение покрытия в поры исходного матрикса и сохранение гистоархитектоники ткани перикарда после нанесения. Результаты антимикробных исследований, а именно способности покрытия подавлять адгезию и рост патогенных бактерий, показывают возможность реализации индуцированного антимикробного ответа за счет изменения набухания полимерных наночастиц и высвобождения антимикробных агентов в случае роста патогена на биопротезе. Было получены весьма обнадёживающие результаты для гибридного матрикса с покрытием из наночастиц хитозана, допированных наночастицами серебра, в плане подавления кальциноза. Оказалось, что такой гибридный матрикс с покрытием содержит только (0,015±0,005) мас.% солей кальция после 4-месячного эксперимента на модельных крысах in vivo, что примерно на порядок ниже, чем, для применяемого в настоящий момент золотого стандарта в кардиохиругии - сшитого глутаровым альдегидом перикарда (0,070±0,015) мас.%.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения второго этапа проекта были исследованы фундаментальные закономерности формирования покрытий на основе наночастиц хитозана, сформированных и нанесённых на модельные подложки и коллагеновую ткань биологических протезов с применением растворов угольной кислоты под давлением. Дополнительно, была изучена возможность получения в растворах угольной кислоты, а также стабильность комплексов хитозана с новыми, впервые синтезированными фторсодержащими соединениями. Синтезированные фторсодержащие хинолины являются альтернативой широко применяемых в медицине антибиотиков таких как ванкомицин, тетрациклин, ципрофлоксацин. В рамках исследований, связанных с новыми синтезированными фторсодержащими хинолинами, были найдены условия получения устойчивых комплексов хитозана с этими соединениями. Установлено, что в растворах угольной кислоты (в бифазной системе Н2О/СО2 под давлением) при давлениях Р=30-50 МПа и температурах T=23-30 ºС лучше всего растворим АФОХ (5-диметиламинометил-7-(2,2,2-трифтор-1-гидрокси-1-трифторметил-этил)-8-оксихинолин). АФОХ формирует с хитозаном в растворе угольной кислоты прозрачный раствор зелено-желтого оттенка и имеет наибольшую среди синтезированных фторхинолинов интенсивность пика на длине волны 254 нм. Установлено, что комплекс с хитозаном НФОХ (7-(1-гидрокси-1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)-5-нитро-8-оксихинолин) при найденных условиях растворим хуже, и имеет меньший пик по интенсивности на длине волны 257 нм, ну и, наконец, ФОХ (5,7-ди-(1-гидрокси-1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)-8-оксихинолин), плохо растворим, что подтверждается слабым сигналом на 251 нм и осадком в растворе. Была изучена стабильность комплексов хитозана с широко применяемыми антибиотиками. Оказалось, что наибольшую стабильность, после длительной экспозиции (больше года), демонстрируют комплексы хитозана с АФОХ и ципрофлоксацином, которая обеспечивается за счёт образования многочисленных водородных связей в комплексе и надежной фиксацией с макромолекулами хитозана. В свою очередь, тетрациклин и ванкомицин деградируют, что выражается в зашкаливающем сигнале УФ-спектра растворов таких комплексов с хитозаном. Было обнаружено, что при нанесении наночастиц хитозана (сформированных в растворах угольной кислоты методом ионного гелирования) из растворов угольной кислоты, с возрастающей концентрацией полимерных наночастиц, происходит самоорганизация наночастиц в «нити», образующих единую связанную сетку в некоторых областях подложки. Можно предположить, что при дальнейшем повышении концентрации покрытие, сформированное нанесением из раствора угольной кислоты составных наночастиц, будет однородное по толщине с высокой степенью взаимных зацеплений частиц друг с другом, что должно благоприятно сказаться на механической стабильности покрытия. Действительно, исследование влияния некоторых параметров нанесения (давление и длительность экспозиции) составных наночастиц хитозана, допированных наночастицами серебра (ХТЗ_Ag/ТПП), из растворов в угольной кислоте на матрицы перикарда из растворов в угольной кислоте показывают усиление прочности биоматериала (Δσ на ⁓40% больше, чем для контрольного) с сохранением эластичности при давлении Р=30 МПа и времени экспозиции 3-6 часов. Был доказан факт изменения конформации составных наночастиц и усиление высвобождения лекарственных средств из них при условиях, моделирующих инфекционное заражение биопротеза. С помощью метода АСМ было установлено, что составные наночастицы ХТЗ_Ag/ТПП полученные в угольной кислоте и нанесённые на модельную подложку существенно изменяют свой диаметр при понижении рН среды с значения 7,4 до 5,0. Оказалось, что частицы при понижении рН увеличивается в размере в среднем с (20±5) нм для рН=7,4, до (75±20) нм для рН=5,0. Исходя из полученных результатов по структурному переходу наночастиц при понижении рН, можно предположить, что при инфекционном заражении, в результате расправления полимерной оболочки составной наночастицы, будет наблюдаться усиленное высвобождение лекарственного вещества. С помощью высокоточного метода радиоактивных индикаторов, на модельном эксперименте с раствором наночастиц хитозана допированных ванкомицином и полученных методом ионного гелирования в растворах угольной кислоты (ХТЗ_Ванк/ТПП) были проведены исследования закономерностей высвобождения лекарства (ванкомицина). При моделировании инфекционного заражения (pH раствора с наночастицами – 5,0) и нормальных физиологических условий (рН раствора 7,4) было установлено, что при нормальном pH в течение получаса происходит высвобождение некоторой доли, слабо инкапсулированного в полимерную оболочку наночастиц, ванкомицина (около 15 % от общего количества допированного антибиотика), затем в течение трёх суток выходит ещё 10 % и кривая высвобождения ванкомицина выходит на плато. В случае имитации роста патогенной биоплёнки, в первые полчаса высвобождается 25 % от общего количества допированного лекарства и еще 12 % в течение трёх суток. Следовательно, можно говорить о том, что при инфекционном заражении импланта количество высвобождающегося ванкомицина увеличивается на 15 %, по сравнению с нормальным состоянием. Кроме того, стоит отметить, что ванкомицин из полимерной матрицы десорбируется не полностью, таким образом, можно предположить, что при повторных заражения можно ожидать эффективный антимикробный ответ. Таким образом, выявленные закономерности высвобождения антибиотика из наночастиц хорошо согласуется с модельными экспериментами по исследовании кислотности среды на конформацию адсорбированных наночастиц хитозана. Было обнаружено, что покрытие на основе наночастиц ХТЗ_Ванк/ТПП полностью подавляет адгезию и дальнейший рост бактерий S. Aureus на биоматрице (выживаемость), в то время как тестируемый образец коллагена без покрытия очень хорошо адгезирует патогены на поверхности и не ингибирует их дальнейший рост. Была исследована стабильность получаемого покрытия на основе наночастиц ХТЗ_Ванк/ТПП с помощью модельного in vivo эксперимента на крысах, в ходе которого животным были имплантированы матрицы ГА-перикарда с покрытием на 4 месяца. Было установлено, что количество хитозана в результате биорезорбции снижается до 30-35 % от исходного ((1,05±0,05) вес.%) после 4 месяцев нахождения в крысах. Такое количество хитозана вполне достаточно для маскирования остаточных альдегидных групп на поверхности перикарда и ингибирования развития кальциноза. С другой стороны, впервые было выявлено, что ванкомицина исходно адсорбируется на матрикс (0,16±0,03) вес.%, а остается после эксперимента – (0,08±0,02) вес.%. Таким образом, соотношение антибиотик/хитозан выросло после опыта– было (15±3) %, стало (30±10) %, р<0,005. Такое изменение соотношения антибиотик/хитозан является косвенным доказательством того, что ванкомицин допирован («закручен») в полимерные частицы. Таким образом, удалось установить, что покрытие на основе наночастиц хитозана, допированных ванкомицином, полученных в угольной кислоте, а также нанесенных на коллагеновые матрицы ГА-перикарда из растворов в угольной кислоте устойчиво к биорезорбции. Полученные результаты позволяют ожидать сохранение устойчивости биоимплантата с новым покрытием ХТЗ_Ванк/ТПП в плане подавления кальциноза и микробного заражения коллагеновой матрицы и, соответственно, потенциально долгую работу биопротеза. Наконец, была доказана биосовместимость биоматриксов с покрытием на основе наночастиц хитозана, полученным в растворах угольной кислоты. Исследование цитотоксичности биоимплантов показало, что образцы с новым покрытием на основе наночастиц наночастиц хитозана, не только является биосовместимыми, но и, более того, способствует увеличению пролиферации клеток, то есть являются перспективными с точки зрения создания самообновляющихся биоимплантатов.