Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках работ по проекту в отчетном году нами была предложена теоретическая модель монослойнойной мембраны, являющаяся модификацией модели Хамма–Козлова бислойной мембраны. Нами было показано, что в рамках этой модели липидный монослой ведёт себя, как бесконечно тонкая двумерная плёнка, а его спонтанная кривизна определяется средневзвешенным значением от величин спонтанной кривизны двух компонент. В частности, увеличение доли фосфатидилэтаноламина приводит к уменьшению спонтанной кривизны мембраны, а увеличение доли липидов с насыщенными хвостами (пальмитоил) — к увеличению спонтанной кривизны. Для оценки влияния триолеина на упругие характеристики мембраны методом молекулярной динамики нами был получена зависимость латерального напряжения от поперечной координаты, что позволило определить модуль изгиба. В результате проведенных вычислений было показано, что значения спонтанной кривизны мало отличались от значений, полученных для монослоя в составе бислойной мембраны. Это означает, что наличие триолеина не оказывает непосредственного влияния на упругие характеристики монослойной мембраны. С учётом полученных представлений об упругих свойствах монослоя липида на границе вода–триолеин нами была разработана теоретическая модель безбелкового слияния двух липидных монослоёв. В рамках разработанной модели была получена зависимость энергетического барьера на слияние от липидного состава сливающихся монослоев. Было показано, что добавление в мембраны 50% этаноламина приводит к понижению барьера на 25 kB*T, что качественно соответствует тенденции для бислойного слияния. Для более полного сравнения результатов по монослойному и бислойному слиянию нами был смоделирован промежуточный случай монослойно-бислойного слияния. Проведенные нами расчеты указывают на то, что выпячивание монослойной мембраны энергетически более выгодно, чем выпячивание бислойной. Это приводит к понижению высоты барьера монослойно-бислойного слияния по сравнению с барьером бислойного слияния. При этом энергетический барьер на монослойно-бислойное слияние также понижается при увеличении доли DOPE. Для оценки изменения средних размеров липидных капель нами была использована теория коагуляции капель в эмульсии, позволяющая описать изменение их концентрации в эмульсии во времени как функцию высоты энергетического барьера на коагуляцию. В результате мы получили зависимость среднего диаметра частиц в эмульсии от высоты барьера E в заданный момент времени. В дальнейшем это позволит определить высоту энергетического барьера по имеющейся кинетике увеличения диаметра частиц в эмульсии при разных температурах. Нами была отработана методика приготовления эмульсии бинарных систем, моделирующих липидные капли и состоящих из смеси триолеина и фосфатидилхолина (т.н. адипосом). Распределение частиц в эмульсии по диаметру измеряли методом ДРС. Предварительные данные показывают, что частицы, покрытые фосфатидилхолином, не меняют своего размера на протяжении 1.5 суток в диапазоне температур от 25 до 50 С. На основании полученных результатов нами был сделан вывод о стабильности эмульсии адипосом в условиях эксперимента. Предварительные данные об электрокинетическом потенциале полученных адипосом показали значения, близкие к нулю. По нашему мнению, это свидетельствует о высоком барьере на слияние таких частиц и соответствует полученным нами ранее теоретическим результатам.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 году нами были выполнены работы по оценке высоты энергетического барьера на слияние модельных липидных капель, адипосом, тремя методами — с помощью молекулярно-динамических (МД) расчетов, теоретических расчетов и по результатам экспериментов методом динамического светорассеяния (ДРС). Во всех методах исследовалось влияние состава липидной монослойной оболочки адипосом на высоту барьера; для этого изучались адипосомы, в оболочку которых входили липиды диолеолифосфатидилхолин (DOPC) и диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE) в разной пропорции. Наибольший упор был сделан на экспериментах по ДРС; были проведены измерения кинетики изменения концентрации частиц в эмульсиях для четырех составов при разных температурах. Исследовались эмульсии адипосом с долей DOPE 0, 20, 35 и 50%. Состав адипосом контролировался с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ); данные ТСХ свидетельствуют о качественном соответствии состава получающейся эмульсии исходному составу смеси. Для анализа получавшейся в результате экспериментов зависимости относительной концентрации от времени использовалась разработанная ранее модель коалесценции и флокулляции в разбавленных эмульсиях. Эта модель позволила нам определить по экспериментальным данным зависимость характерного времени коалесценции от температуры для каждого из составов, в результате чего мы получили энергетический барьер на коалесценцию (слияние). Мы получили следующие величины для высоты барьера: 32 kBT для эмульсий с 20% DOPE; 28 kBT для эмульсий с 35% DOPE; 23 kBT для эмульсий с 50% DOPE. Для случая монослойной оболочки из чистого DOPC высоту барьера определить не удалось из-за большой стабильности получавшейся эмульсии. Для подтверждения обоснованности использования выбранной кинетической модели мы провели эксперимент по визуализации эмульсии липидных капель при условиях, предположительно, наиболее соответствующих их слиянию. Для эксперимента готовили концентрированный раствор липидных капель, содержащий липиды DOPC:DOPE в соотношении 65:35 и 0.5% флуоресцентно меченный липид Rho-DOPE. Измерения проводили на инвертированном флуоресцентном конфокальном микроскопе. Изображения регистрировали как для свежеприготовленных адипосом, так и после их инкубирования при 40 оС в течение 2 часов. В результате измерений наблюдалось увеличение размеров флуоресцирующих частиц, на основании чего был сделан вывод о быстрой коалесценции. Сопоставление размеров частиц в двух измерениях позволяет говорить о качественном соответствии скорости коалесценции при сравнении со значением, полученным методом ДРС для данной температуры и состава. Полученные результаты свидетельствуют в пользу выбранной кинетической модели слияния частиц в эмульсии и подтверждают ее обоснованность. Высота барьера на слияние липидных монослоев была также определена методами МД и с помощью теоретических расчетов. Моделировались монослойные оболочки, содержащие 0, 25 и 50% DOPE в своем составе. Мы исходили из литературных данных, согласно которым DOPE способствует бислойному слиянию. В теоретической модели предполагалось, что добавление DOPE приводило к изменению спонтанной кривизны монослоя, параметров гидратационного отталкивания, а также начального расстояния между мембранами. В МД расчетах начальное расстояние фиксировалось и не менялось. В результате мы получили следующие значения барьеров на слияние: для монослойных оболочек без DOPE МД расчеты дали величину E = 26.5 kBT, теоретические расчеты 36 kBT; для оболочек с 25% DOPE 23.7 kBT и 33 kBT, соответственно; для оболочек с 50% DOPE 22.5 kBT и 26 kBT, соответственно. Как видно, результаты МД показывают в целом несколько заниженное значение высоты барьера. Такой результат связывается нами с увеличенным, по сравнению с МД, значением начального расстояния H0 в теоретических расчетах. Увеличение доли DOPE приводит к увеличению H0, что увеличивает энергию, необходимую для сближения мембран. Сравнение полученных высот барьеров показывает удовлетворительное соответствие результатов для разных составов мембран. Высоты барьеров находятся в диапазоне 20 – 35 kBT и уменьшаются с добавлением DOPE в состав липидного монослоя. Следует отметить, что вне зависимости от метода определения при малом содержании DOPE барьер на слияние оказывается достаточно большим для его преодоления за физиологически разумное время. Липидные капли в живых системах имеют в своем составе примерно 20% DOPE (Bartz, et al., 2007): высота барьера на слияние в этом случае составляет 32 kBT. Это свидетельствует об устойчивости липидных капель в отсутствие белков, ускоряющих слияние, что подтверждается литературными данными (Barneda et al., 2015). Сравнение с результатами (Kalutsky et al., 2022) и (Akimov, Polynkin, 2018) говорит о резком падении высоты барьера по сравнению с бислойным слиянием для случая мембраны, состоящей из чистого DOPC. Если для бислойного слияния высота барьера в цитированных работах составляла 44 kBT и 44.5 kBT, соответственно, то для монослойного слияния она составила, в зависимости от метода, от 26.5 до 36 kBT, то есть в полтора–два раза меньше. Список цитированной литературы. 1. Akimov, S. A., Polynkin, M. A., Jiménez-Munguía, I., Pavlov, K. V., & Batishchev, O. V. (2018). Phosphatidylcholine membrane fusion is pH-dependent. International Journal of Molecular Sciences, 19(5), 1358. 2. Barneda, D., Planas-Iglesias, J., Gaspar, M. L., Mohammadyani, D., Prasannan, S., Dormann, D., ... & Christian, M. (2015). The brown adipocyte protein CIDEA promotes lipid droplet fusion via a phosphatidic acid-binding amphipathic helix. Elife, 4, e07485. 3. Bartz, R., Li, W. H., Venables, B., Zehmer, J. K., Roth, M. R., Welti, R., ... & Chapman, K. D. (2007). Lipidomics reveals that adiposomes store ether lipids and mediate phospholipid traffic1, s. Journal of lipid research, 48(4), 837-847. 4. Kalutsky, M. A., Galimzyanov, T. R., & Molotkovsky, R. J. (2022). A model of lipid monolayer–bilayer fusion of lipid droplets and peroxisomes. Membranes, 12(10), 992.