КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-19-00824
НазваниеРазработка многофункциональной платформы СИМП-СЭХМ-ГКР для фенотипирования раковых клеток
РуководительПархоменко Юрий Николаевич, Доктор физико-математических наук
Прежний руководитель Корчев Юрий Евгеньевич, дата замены: 31.01.2023
Организация финансирования, регион Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСИС", г Москва
Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 09 - Инженерные науки, 09-704 - Микро- и наноэлектромеханические устройства
Ключевые словаСканирующая ион-проводящая микроскопия, электрохимическая микроскопия, TERS, Рамановская спектроскоппия, нанокапилляр, ввизуализация живых клеток, фенотипирование раковых клеток
Код ГРНТИ59.00.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Понимание механизма действия лекарственных препаратов и разработка новых препаратов для эффективной противоопухолевой терапии – один из важнейших вопросов здравоохранения в Мире. Двумя важными нерешенными задачами остаются: изучение влияния липидно-белковой организации плазматической мембраны биологической клетки на поглощение и высвобождение вирусов, пептидных гормонов и наночастиц, переносящих лекарств, а также, связывание морфологии, перицеллюлярного pH, активных форм кислорода (АФК) и механических свойств отдельных раковых клеток с экспрессией генов. В настоящем проекте будет разработана многофункциональная платформа SICM-TERS для одновременных корреляционных исследований топографии поверхности, формирования внутриклеточных активных форм кислорода (АФК), профиля локальных значений pH и динамики нанодоменов клеточной мембраны, для фенотипирования неоднородности отдельных клеток. Такая интеграция трехмерного картирования, распределения pH, АФК, механических свойств клеток и динамики нанодоменов клеточной мембраны с геномикой единичных клеток, в перспективе, поможет связать форму, функцию и связь клеток с регуляцией генов при онкологических заболеваниях.
Для достижения цели проекта, необходимо разработать уникальные многофункциональные нанокапилляры SICM, модифицированные для одновременного использования для TERS и для электрохимических измерений. Для разработки нанокапилляров будут проведены комплексные исследования, направленные на поиск закономерностей воспроизводимого формирования плазмонных наночастиц на поверхности нанокапилляров с использованием метода вакуум-термического испарения и изучение морфологии и оптических свойств и параметров TERS-активности (предел детектирования, фактор усиления, средний фактор усиления подложки для тестовых органических соединений). Интеграция этих методов в одной платформе позволит получать широчайший набор дополнительной информации об образце, в том числе определять конкретные фенотипы для дальнейшей геномики единичных клеток в зависимости от pH и механических свойств отдельных раковых клеток.
Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будет разработана многофункциональная платформа для одновременных корреляционных исследований топографии поверхности, формирования внутри- и внеклеточных метаболитов, профиля локальных значений pH и динамики нанодоменов клеточной мембраны, для фенотипирования неоднородности единичных клеток. Разработанная платформа найдет применения в научных организациях, ведущих фундаментальные и прикладные исследования в области биомедицины, нано и биотехнологий. В связи с уникальностью научно-исследовательских работ, сложностью инженерно-конструкторских решений в разработанной платформе, результатам проекта будет дана надежная правовая защита, которая позволит гарантировать приоритет российских исследователей в этой области. Приоритет российской науки над общемировой позволит в дальнейшем осуществлять промышленное производство, в том числе на экспорт, именно силами российских производителей, что однозначно повлечет за собой развитие точного приборостроения и связанных с ним отраслей в масштабах РФ. Кроме того, появление отечественной технологии, лежащей на стыке нанотехнологий и живых систем, приведет к развитию исследований и росту общего технологического уровня именно на территории РФ, даст толчок к появлению целого ряда импортозамещающей продукции российского производства.
В перспективе, с помощью разрабатываемой в настоящем проекте платформы, будет возможно проводить исследование экспрессии генов различных субпопуляций на уровне единичных клеток. Дальнейшее развитие и применение разрабатываемой многофункциональной платформы позволит отбирать клеточные субпопуляции для выполнения функционально-ориентированного секвенирования одной клетки и, таким образом, понимать клеточную гетерогенность и пластичность, развитие стволовых клеток и даже терапевтическую устойчивость на уровне отдельных клеток. Такая универсальная аналитическая платформа будет представлять интерес для клеточных биологических и биофизических исследований, а также для прикладных исследований связанных с разработкой лекарственных препаратов и создания клинических методов диагностики социально значимых заболеваний.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1 Был успешно оптимизирован протокол изготовления двуканальных капилляров для получения нанокапилляров с внешним диаметром ~ 20 нм и короткой длиной конуса <500 мкм. Были получены нанокапилляры с наименьшим уровнем электрического тока (Irms) для оптимальной работы обратной связи. Уровень шума составил 1,6 пА при частоте фильтрации 4 кГц.
2 Был сделан вывод, что наиболее эффективной методикой осаждения из приведённых являлась с использованием приёма кручения, так как только она позволяет получать однородные массивы наночастиц. Кроме того, она позволяет провидить процесс нанесения в один этап, а размер частиц и их плотность распределения можно контролировать, меняя скорость оборотов. Статические методики нанесения были признаны недостаточными вследствие многоэтапности процессов нанесения, неравномерного распределения частиц и больших трудозатрат в отличии от методики использующую приём кручение.
3 Было проведено исследование TERS-активности модифицированных нанокапилляров плазмонными наночастицами (Au, Ag) по отношению к тестовым органическим соединениям в зависимости от их геометрических параметров и состава. Был определен оптимальный условия отжига нанокапилляров с наночастицам для получения эффекта усиления сигнала
4 Было проведено оценка корреляции между основными параметрами TERS-активности модифициорованных нанокапилляров плазмонными наночастицами и их геометрическими параметрами (диаметр, расстояние между ними) и выбор оптимальной морфологии TERS-активных наноматериалов для анализа биологических объектов. Было установлено, что для длин волн лазера 405 нм и мощности в диапазоне от 0,3 мВт до 3 мВт спектры комбинационного рассеяния света с капилляров, полученных при использовании разработанных методик, не содержали характеристических мод родамина 6G. Для длин волн лазера 633 нм и мощности в диапазоне от 0,4 мВт до 5 мВт спектры комбинационного рассеяния света с капилляров, полученных при использовании разработанных методик, также не содержали характеристических мод родамина 6G. Для 532 нм были проведены исследования с применением мощности в диапазоне 0,0001-5 мВт. При использовании капилляра с методикой одного последовательного осаждения на изображение характеристические моды родамина 6G отсутствуют и было обнаружено наличие флуктуаций или случайного отклонения интенсивности, что связано с нагреванием кончика капилляра, которое появляется в следствии использование больших мощностей лазера и снятия большого количества последовательных измерений, полученных с одного и того же капилляра
Были определены характеристические моды R6G, которые использовали для расчёта коэффициента усиления ГКР-активного капилляра были следующими: 614 см-1, 1184 см-1, 1648 см-1. На основе полученных вычислений был сделан вывод, что рассчитанная величина коэффициента усиления модифицированного капилляра составила ~ 103.
5 Были успешно разработаны методы получения pH чувствительный капилляров. Была получена калибровочная кривая для изготовленного pH-чувствительного нанокапилляра. Был изготовлен двухканальный нанокапилляр по ранее разработанной методике (Пункт 1). Один канал был модифицирован пиролитическим углеродом и электрохимически осажденной платиной. Второй канал не был модифицирован в целях дальнейшего заполнения необходимым электролитом для использования сканирования поверхности в режиме обратной свзяи SICM.
На первом этапе выполнения проекта было подготовлено 5 публикаций с учетом квартиля в изданиях индексируемых Web of Sciense или Scopus
Публикации
1. Абакумова Т., Ванеев А., Науменко В., Шохина А., Белоусов В., Микаелян А., Балышева К., Горелкин П., Ерофеев А., Зацепин Т. Intravital electrochemical nanosensor as a tool for the measurement of reactive oxygen/nitrogen species in liver diseases Journal of Nanobiotechnology, 20, 497 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1186/s12951-022-01688-z
2. Гаранина А.С., Ефремова М.В., Мачулкин А.Е., Любин Е.В., Воробьева Н.С., Жиронкина О.А., Стрелкова О.С., Киреев И.И., Алиева И.Б., Узбеков Р.Е., Агафонов В.Н., Щетинин И.Б., Федянин А.А., Ерофеев А.В., Савченко А.С., Горелкин П. , Абакумов М.А. Bifunctional Magnetite–Gold Nanoparticles for Magneto-Mechanical Actuation and Cancer Cell Destruction Magnetochemistry, 8(12), 185 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/magnetochemistry8120185
3. Мачулкин А.Е., Нименко Е.А., Зык Н.Ю., Успенская А.А. , Смирнова Г.Б., Хан И.И., Покровский В.С., Ванеев А.Н., Мамед-Набизаде В.В., Заверткина М.В., Ерофеев А.С. , Горелкин П.В., Мажуга А.Г., Зык Н.В., Елена Сергеевна Хазанова Е.С., Белоглазкина Е.К. Synthesis and preclinical evaluation of small-molecule prostate-specific membrane antigen targeted abiraterone conjugate Molecules, 27(24), 8795 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/molecules27248795
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках проекта успешно выполнена разработка оригинальной методики анализа релевантных биологической модели. В качестве биологической модели выбраны клетки HEK-293 адгезированные на поверхность культуральных чашек Петри для дальнейшего усиления рамановского рассеяния. Кроме того, успешное проведена разработка метода локальной перфорации мембраны использованной биологической модели для дальнейшего получения рамановского спектра внутриклеточного пространства и отдельных компартментов живой клетки. Также, была проведена модернизация приборной базы для работы с модифицированными TERS - нанокапиллярами, обеспечивающая возможность для проведения коррелятивного сканирования топографии поверхности, измерения концентрации внутриклеточных форм кислорода (АФК) и pH.В ходе выполнения проекта успешно выполнена оптимизация и настройка оптического пути разработанной приборной базы, при соблюдении необходимых конструктивных решений, оптимизированных для проведения TERS-экспериментов. Так, фокусировка лазерного на острие модифицированного TERS-нанокапилляра проведено путем установки источника лазерного излучения через C-mount разъем системы оптической визуализации Ti-2 (Никон, Япония) для осуществления оптического доступа сбоку. Фокусировка лазерного луча произведена через оптический путь AUX для обеспечения доступа прохождения лазерного луча через объектив с увеличением 40х (Никон, Япония). Далее, проведена фокусировка лазерного луча для рамановского усиления на острие модифицированного -TERS нанокапилляра. Затем, производится регистрация полученного сигнала рассеяния производится в фотодетекторе. Была выполнена доработка методики формированию плазмонных наночастиц на поверхность нанокапилляра методом вакуум-термического испарения при вращении модифицируемого нанокапилляра. Нами были описаны закономерности между геометрическими параметрами массивов плазмонных наночастиц на поверхности модифицированных нанокапилляров и коэффициентом усиления сигнала рамановского рассеяния. Был проведен подбор наиболее оптимальных скоростей вращения капилляра и навески плазмонного материала для получения наибольшего коэффициента усиления. Был выполнен расчёт коэффициента усиления на основе спектра, полученного с нанокапилляра изготовленного по методике с вращением капилляра. В результате исследований доработана методика изготовления модифицированного нанокапилляра для спектроскопии комбинационного рассеяния. Доработанная методика включает в себя испарение 30 мг серебра на вращающийся со скоростью 14 об/сек капилляр, находящийся строго над испарителем на высоте 20 см. В результате формируется массив наночастиц средним диаметром 36 нм и расстоянием между частицами порядка 12 нм. Коэффициент усиления полученной по описанной методике структуры составил порядка 7×105, а предел обнаружения вещества R6G достиг 50 нМ. Установлено, что кратковременная обработка модифицированного нанокапилляра в растворе 0,3% кислоты с последующей промывкой в деионизованной воде незначительно влияет на геометрию массива наночастиц, изменяя диаметр частиц и расстояние между ними в пределах 2 нм. Установлено, что обработка модифицированного нанокапилляра не влияет на качество получаемого спектра.
В рамках проекта был разработан дополнительный программный модуль для обработки и анализа данных рамановской спектроскопии. Этот модуль является частью программы, предназначенной для вывода спектра. На интерфейсе программы вкладка для построения спектра расположена наряду с вкладками для вывода топографии, кривизны, 3D модели клетки, карт падений ионного тока и карты модуля Юнга (Рисунок 22). Для каждой отсканированной клетки помимо топографии и файлов SP1 и SP2 также имеется файл формата .csv или в формате текстового файла. Файл представляет из себя два столбца: первый относится к значениям волнового числа, а второй к значениям интенсивности. Для построения спектра необходимо нажать на вкладку Spectroscopy, после чего в правой части будет выводиться спектр клетки.
Публикации
1. Дубков С.В., Оверченко А.Д.,Новиков Д.В.,Колмогоров В.С.,Волкова Л.С.,Горелкин П.В.,Ерофеев А.С., Пархоменко Ю.Н. Single-Cell Analysis with Silver-Coated Pipette by Combined SERS and SICM Cells, Volume 12 Issue 21, р. 2521 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/cells12212521
2. Н.А. Савин, А.С, Ерофеев, Р.В. Тимошенко, А.Н. Ванеев, А.С, Гаранина, С.В. Салихов, Н.Э. Грамматикова, И.В. Левшин, Ю.Е. Корчев, П.В. Горелкин Investigation of the Antifungal and Anticancer Effects of the Novel Synthesized Thiazolidinedione by Ion-Conductance Microscopy Cells, 2023, 12(12), 1666 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/cells12121666