Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Произведен дизайн олигонуклеотидных инсектицидов (ДНК-инсектицидов) на основе антисмысловых последовательностей генов 5,8S и 28S рибосомальных РНК (ICER-11, 5′-ACA CCG ACG AC-3′; Coccus-11, 5′-CCA TCT TTC GG-3′; Macsan-11, 5′-TGT GTT CGT TA-3′) австралийского желобчатого червеца (Icerya purchase Maskell), мягкой ложнощитовки (Сoccus hesperidum L.) и хризантемовой тли (Macrosiphoniella sanborni Gillette) и контрольных ДНК-олигонуклеотидов (ICER-11-3′, 5′-ACA CCG ACG AG-3′; ICER-11-5′, 5′-TCA CCG ACG AC-3′; ICER-11-C6, 5′-ACA CCC ACG AC-3′; ACTG-11, 5′-ACT GAC TGA CT-3′; Macsan-11-3′, 5’-TGT GTT CGT TT-3′; Macsan-11-5′, 5′-AGT GTT CGT TA-3′) с помощью базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), применения алгоритма веб-приложения BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и разработанной нами программы DNAInsector (http://dnainsector.com/). Также произведен подбор и синтез специфических праймеров для оценки величины экспрессии выбранных генов для воздействия на них ДНК-инсектицидов и контрольных ДНК-олигонуклеотидов (ICER-F, 5′-AGG ATT CAC ACG GTG GAG TC-3′ и ICER-R, 5′-GCA AGT GCA CAA CTT GAA CG-3′, прямой и обратный праймер для ПЦР 28S рРНК австралийского желобчатого червеца; Coccus-F, 5′-ACC GTC GAC GAA CTG G-3′ и Coccus-R 5′-ACG TCA GAA TCG CTG C-3′, прямой и обратный праймер для ПЦР 28S рРНК мягкой ложнощитовки; Agex-F, 5′-TGC AAG TGC GCT TCC ACT TA-3′ и Agex-R, 5′-TAG CAG ACG AAA CGG CAG AT-3′, прямой и обратный праймер для ПЦР 5,8S рРНК хризантемовой тли). 2. Осуществлен синтез разработанных ДНК-инсектицидов и контрольных ДНК-олигонуклеотидов против насекомых-вредителей амидофосфитным методом на автоматических ДНК синтезаторах (ASM-800E для малых объемов и ASM-10 для больших объемов, БИОССЕТ, Россия) и их очистка на установке для ручной очистки олигонуклеотидов (OPS-12, Биоссет, Россия) используя следующие реактивы как экономически эффективную альтернативу стандартным: – 3% раствор трихлоруксусной кислоты в дихлорметане используемый для деблокирования заменен на раствор п-толуолсульфокислоты в ксилоле с концентрацией 4 г/л; – раствор 5-этилтиотетразола используемый в качестве активатора заменен на раствор п-толуолсульфокислоты в ацетонитриле с концентрацией 3 г/л; – раствор окислителя 0.1M Йод в ТГФ/Пиридин/H2O 80:10:10 заменен на раствор гидроперита 24 г/л ацетонитрила с добавлением 30 мл деионизированной воды. После раствор фильтровали и упаривали в вакууме на ротационном испарителе (Heidolph, Германия). Полученное твердое вещество растворяли в деионизированной воде до нужной концентрации, измеряя её на спектрофотометре NanoDrop Lite (Thermo Fisher Scientific, США). Структура синтезированных фрагментов проверялась на соответствие с помощью сравнения их молекулярных масс измеренных методом МАЛДИ на приборе BactoSCREEN (Литех, Россия) с теоретически рассчитанными молекулярными массами. 3. Разработанный против австралийского желобчатого червеца ДНК-инсектицид ICER-11, направленный на 28S рРНК вредителя, по сравнению с контролем показал достоверный инсектицидный эффект на третьи, седьмые и десятые сутки эксперимента. Смертность личинок составила 14,02 ± 2,79%, 28,67 ± 3,51% и 42,29 ± 2,25%; 20,09 ± 6,26%, 33,67 ± 2,52% и 45,05 ± 4,74%; и 23,70 ± 8,98%, 35,33 ± 2,08% и 70,55 ± 0,77% в группах контроль, АКТАРА® и ICER-11 соответственно на третьи, седьмые и десятые сутки после обработки. Препарат использовался в концентрации 100 мг/л. Разработанный против мягкой ложнощитовки ДНК-инсектицид Coccus-11 в концентрации 100 мг/л показал значительную смертность насекомых уже на 2-й день эксперимента 53,53 ± 9,99%. Аналогичные результаты были получены на 2-е сутки при использовании препарата АКТАРА® в концентрации 1 г/л 68,94 ± 22,63%. На 12-е сутки эксперимента смертность от ДНК-инсектицида достигла 95,59 ± 1,63%. Аналогичные данные были получены для АКТАРА®, к концу эксперимента в группе Coccus-11 смертность составила 94,7 ± 4,11%. Контрольный олигонуклеотид ACTG-11 не проявлял значительного инсектицидного действия по сравнению с контрольной группой (обработанной водой). Летальность в группе ACTG-11 составила 23,53 ± 2,51% на 12-е сутки. Разработанный против хризантемовой тли ДНК-инсектицид Macsan-11, основанный на последовательности 5,8S рРНК вредителя, показал высокую эффективность, приводящую к смертности 67,15 ± 3,32% особей к 7 дню эксперимента после однократной обработки и 97,38 ± 2,49% к 7 дню эксперимента после двукратной обработки препаратом с концентрацией 100 мг/л с суточным интервалом. Также было изучено влияние двух сходных фрагментов – Macsan-11-3′ и Macsan-11-5′. Они не оказали значимого влияния на смертность тли. За 7 суток смертность достигла 5,07 ± 0,47% и 5,92 ± 0,25%. 4. Подобрана оптимальная концентрация ДНК-инсектицидов и контрольных ДНК-фрагментов для обработки насекомых-вредителей: австралийского желобчатого червеца, мягкой ложнощитовки, хризантемовой тли. Наиболее эффективной и экономически обоснованной дозой препаратов является концентрация 100 нг/мкл, т.к. она позволяет достигать смертности насекомого-вредителя на уровне химических инсектицидов, например, препарат АКТАРА®. Мы установили, что создание ДНК-инсектицидов в виде готового к употреблению препарата для борьбы с насекомыми-вредителями, приготовленного с помощью твердофазного синтеза на автоматических ДНК-синтезаторах с использованием стекла с регулируемыми порами в качестве твердой подложки, стоило около 0,5 доллара США за мг или 0,5 доллара США на метр квадратный листьев растений. Хотя на сегодняшний день он не доступен по цене по сравнению, например, с неоникотиноидами инсектицидами, такими как тиаметоксам (0,05 долларов США за мг), однако в будущем они могут составить конкуренцию традиционным инсектицидам, если стоимость синтеза ДНК будет снижена. 5. По итогам выполнения проекта написано 5 статей, из которых опубликованы 3 статьи, одна из них в журнале из баз данных Scopus (Q1) и 2 статьи в журнале, индексируемом библиогрфическими базами данных РИНЦ и Google Scholar, 1 статья находится на стадии принятия правок и публикации в журнале из баз данных Scopus (Q3) и 1 статья из журнала базы данных Scopus (Q1) на рассмотрении и отправлена в Preprints: 1. Oberemok, V.V., Useinov, R.Z., Skorokhod, O.A., Gal’chinsky, N.V., Novikov, I.A., Makalish, T.P., Yatskova, E.V., Sharmagiy, A.K., Golovkin, I.O., Gninenko, Y.I., Puzanova, Y.V., Andreeva, O.A., Alieva, E.E., Eken, E., Laikova, K.V., Plugatar, Y.V. Oligonucleotide insecticides for green agriculture: regulatory role of contact DNA in plant-insect interactions. International Journal of Molecular Sciences. 2022; 23(24):15681. Scopus – Q1 (импакт-фактор - 6,2). (опубликована – https://www.mdpi.com/1422-0067/23/24/15681); 2. Пузанова Е.В., Оберемок В. В. Инновационный олигонуклеотидный инсектицид Хрит-11 показывает высокую эффективность и избирательность действия на Macrosiphoniella sanborni Gillette / Экосистемы. – 2022. – Вып. №31, – С. 155-162. Библиографические базы данных РИНЦ и Google Scholar. (опубликована – http://ekosystems.cfuv.ru/arhiv/); 3. Новиков И. А., Яцкова Е.В., Шармагий А.К., Пузанова Е.В., Билык А.И., Оберемок В.В. Инновационный постгеномный подход в борьбе с лавровой листоблошкой Trioza alacris Flor. / Экосистемы. – 2022. – Вып. №31, – С. 163-167. Библиографические базы данных РИНЦ и Google Scholar. (опубликована – http://ekosystems.cfuv.ru/arhiv/); 4. Gal'chinsky N., Useinov R., Novikov I., Yatskova E., Sharmagiy A., Trikoz N., Plugatar Y., Lailova E., Oberemok V. Pest control and climate change compromise: a case for Icerya purchasi Maskell and green oligonucleotide insecticides. Journal of Crop Protection. Scopus – Q3. (внесение правок и общение с редакторами перед публикацией); 5. Oberemok, V.V.; Puzanova, Y.V.; Novikov, I.A. Controlled lavender field fragrance: the biotechnological “Provence” of the future provided by antisense oligoilators and olinscides. International Journal of Molecular Sciences. Scopus – Q1. (на рассмотрении в IJMS и отправлена в Preprints 12.12.2022).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Изучено влияние олигонуклеотидного инсектицида ICER-11 на экспрессию целевого гена, кодирующего 28S рРНК австралийского желобчатого червеца Icerya purchasi Maskell. В группе, обработанной олинцидом ICER-11 на 3-и и 7-е сутки исследования было обнаружено достоверное снижение экспрессии гена (в 1,43 ± 0,12 и 6,42 ± 0,12 раза соответственно), кодирующего 28S рРНК, по сравнению с контрольной группой (p < 0,01). Анализ изменения экспрессии целевого гена в контрольной группе "Актара" (Syngenta, Австрия)) по сравнению с контролем не показал достоверного различия (p > 0,05). Изучено влияние олигонуклеотидного инсектицида CJ-11 на экспрессию целевого гена, кодирующего 28S рРНК японской восковой ложнощитовки Ceroplastes japonicus Green. В результате было обнаружено, что концентрация 28S рРНК в клетках насекомых, контактно обработанных олинцидом CJ-11, была на 4-е сутки значительно снижена (в 3,1 ± 0,97 раза), чем в группе контроля, обработанного водой (p < 0,01). Также обнаружили заметное, но статистически недостоверное различие в снижении (в 1,24 ± 0,32 раза) концентрации 28S рРНК у насекомых, в группе, контактно обработанной контрольным олигоACGT-11-фрагментом (p > 0,05). Изучено влияние олигонуклеотидного инсектицида DB-11 на экспрессию целевого гена, кодирующего 28S рРНК британской щитовки Dynaspidiotus britannicus Newstead. Концентрация 28S рРНК в клетках насекомых, обработанных олинцидом DB-11, была на 10-е сутки значительно снижена (в 3,51 ± 0,34 раза), чем в группе контроля (p < 0,01), обработанного водой. Мы также обнаружили статистически достоверное снижение (в 1,6 ± 0,14 раза) концентрации 28S рРНК в группе, обработанной контрольным oлигоC-11-фрагментом (p < 0,01). Изучено влияние олигонуклеотидного инсектицида AL-11 в смешанных популяциях насекомых-вредителей D. britannicus и A. lauri, на концентрацию 28S рРНК в клетках насекомых. В группе, обработанной олинцидом AL-11, было обнаружено статистически достоверное снижение концентрации 28S рРНК в клетках насекомых, на 10-е и 14-е сутки исследования, в 8,44 ± 0,14 и 1,72 ± 0,36 раза соответственно, по сравнению с контрольной группой (p < 0,01), обработанной водой. Изучено влияние олигонуклеотидного инсектицида Coccus-11 на экспрессию целевого гена, кодирующего 28S рРНК мягкой ложнощитовки Coccus hesperidum L. Установлено, что концентрация 28S рРНК в клетках насекомых на 1-е сутки была в 6,31 ± 2,44 раза выше по сравнению с контролем (p < 0,01). Изучено влияние олигонуклеотидного инсектицида UE-11 на экспрессию целевого гена, кодирующего 28S рРНК бересклетовой щитовки Unaspis euonymi. Уставлено, что концентрация 28S рРНК в клетках насекомых, обработанных олинцидом UE-11, на 7-е сутки была в 6,92 ± 1,18 раза ниже, чем у насекомых из контрольной группы (p < 0,01), обработанной водой. Также, было обнаружено статистически достоверное снижение концентрации 28S рРНК в клетках насекомых группы, обработанной контрольным олигоC-фрагментом, в 2,61 ± 0,51 раза, по сравнению с контрольной группой (p < 0,01). Изучено влияние олигонуклеотидного инсектицида Macsan-11 на концентрацию второго внутреннего транскрибируемого спейсера рРНК (ITS2). Установлено, что концентрация ITS2 на 1-е сутки была в 2,57 ± 0,33 раза выше по сравнению с контролем (p < 0,01). Далее этот показатель постепенно снижался – на 2-е сутки он был в 1,39 ± 0,04 раза больше (p < 0,01), на 3-е сутки – в 1,27 ± 0,05 раза больше (p < 0,01). Изучено влияние олигонуклеотидных инсектицидов Alacris-11 и Laura-11 на концентрацию 28S рРНК и ITS2 в составе полицистронного рРНК-транскрипта лавровой листоблошки (Trioza alacris Flor.) соответственно. По сравнению с контролем экспрессия увеличилась в 3,56 ± 0,66 и 2,93 ± 0,16 раза для олинцидов Laura-11 и Alacris-11 соответственно, а для смеси олинцидов Laura-11 с Alacris -11 – в 5,52 ± 0,13 раза, по сравнению с контрольной группой (p<0,05). 2. Произведено секвенирование фрагмента гена 28S рРНК австралийского желобчатого червеца I. purchasi Maskell. Последовательность из 182 нуклеотидов загружена в систему GenBank под номером OR852410.1. Произведено секвенирование фрагмента гена 28S рРНК британской щитовки D. britannicus Newstead. Последовательность из 108 нуклеотидов загружена в систему GenBank под номером OR897816. Произведено секвенирование фрагмента гена 28S рРНК лавровой щитовки A. lauri Bouche. Последовательность из 108 нуклеотидов загружена в систему GenBank под номером OR852409. Произведено секвенирование фрагмента гена 28S рРНК японской восковой ложнощитовки C. japonicus Green. Последовательность из 127 нуклеотидов загружена в систему GenBank под номером OR852411.1. Произведено секвенирование фрагмента гена 28S рРНК мягкой ложнощитовки C. hesperidum L. Последовательность из 86 нуклеотидов загружена в систему GenBank под номером OR889423. Произведено секвенирование фрагмента второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) рРНК хризантемовой тли M. sanborni Gill. Последовательность из 358 нуклеотидов загружена в систему GenBank под номером OR046519.1 У всех насекомых-вредителей (обнаруженных на территории Крымского полуострова) секвенированные фрагменты генов содержали совершенно комплементарные последовательности к примененным сайт-специфиическим олинцидам. 3. Добавление дополнительных веществ (хлорид кальция, триэтилентетраамин (ТЭТА), тэтраэтиламмония йодид, ксантан и низкомолекулярный водорастворимый хитозан) к формуле олинцидов не привело к снижению их стоимости (за счет снижения концентрации целевого олигонуклеотидного инсектицида), а также, не увеличило существенно смертность насекомого-вредителя калинового мучнистого червеца (Pseudococcus viburni Signoret) из подотряда грудохоботных. Изменен состав реагентов и растворителей для синтеза олинцидов. Замена всех растворителей на ацетонитрил упростила подготовку растворов, утилизацию и стоимость синтеза в целом, так как может применяться ацетонитрил технического качества (ЧДА). Также были заменены трихлоруксусная кислота и йод: в деблокирующем растворе на 4-толуолсульфоновую кислоту, а в окисляющем растворе на гидроперит. Также заменен ДДТТ ((диметиламинометилиден)амино)-3H-1,2,4-дитиазолин-3-тион) на аналог – АДТТ (3-амино-1,2,4-дитиазол-5-тион). Состоятельность данного усовершенствования синтеза олигонуклеотидов подтверждается масс-спектрометрией, а также высоким выходом продукта (1 мг на синтез колонки объемом 50 мкл), что соответствует выходу при использовании классического метода без модификаций. Таким образом, замена растворителей и других реактивов позволила снизить стоимость конечного продукта с 1000 рублей за мг до 100 рублей, т.е. в 10 раз. 4. С помощью масс-спектрометрического метода-матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ), установлено, что олигоМасс-11-фрагмент (5′-AGC GAC GTC GС-3′) способен проникать через хитиновый покров в клетки насекомого. МАЛДИ зарегистрировал проникновение олигоМасс-11-фрагмента в в клетки насекомого через 30 минут (пик 3337,63 Да). 5. Опубликовано 3 статьи в журналах из базы данных Scopus (Q1): – Oberemok V.V., et al. Four Most Pathogenic Superfamilies of Insect Pests of Suborder Sternorrhyncha: Invisible Superplunderers of Plant Vitality // Insects. https://doi.org/10.3390/insects14050462 – Gal’chinsky N.V., et al. Icerya purchasi Maskell (Hemiptera: Monophlebidae) Control Using Low Carbon Footprint Oligonucleotide Insecticides // Int. J. Mol. Sci. https://doi.org/10.3390/ijms241411650 – Puzanova Y.V., et al. Perfect Complementarity Mechanism for Aphid Control: Oligonucleotide Insecticide Macsan-11 Selectively Causes High Mortality Rate for Macrosiphoniella sanborni Gillette // Int. J. Mol. Sci. https://doi.org/10.3390/ijms241411690 Ссылка на информационный ресурс в сети Интернет, посвященный проекту: 1. https://scientificrussia.ru/articles/molodye-ucenye-kfu-razrabatyvaut-insekticid-dla-borby-s-tlej 2. https://sevastopol.su/news/smertelno-opasnye-pomoshchniki-zachem-v-krymu-ishchut-zamenu-pesticidam/amp