Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 г. основное внимание уделили подбору популяций карельской березы, которые бы соответствовали целям и задачам проекта. Для этого нами были предложены и использованы следующие критерии (требования): 1) потомство должно быть сибсовым (полученным от контролируемого опыления известных родительских пар); 2) гибридные семьи имеют максимально возможное количество растений; 3) гибридная семья включает потомство от прямого и обратного скрещиваний конкретной родительской пары; 4) деревья внутри семьи характеризуются разнообразием по форме роста и типу поверхности ствола, в т.ч. «без признаков узорчатости»; 5) гибридные семьи, отобранные по указанным критериям, должны представлять разновозрастные насаждения. В результате из известных нам искусственно созданных популяций (насаждений) карельской березы была выбрана Заонежская лесосеменная плантация (ЛСП), находящаяся в юго-восточной части Карелии. На основании экспедиционных обследований (июнь 2022 г.) в разновозрастных (15 и 35 лет) насаждениях, сформированных сибсовым потомством, среди 38 гибридных семей отобраны четыре, полученные от прямого и обратного скрещиваний двух родительских пар. Определена экспериментальная выборка, состоящая из 201 дерева, произрастающих на двух участках ЛСП. В ходе экспедиции для проведения молекулярно-генетических исследований собраны растительные образцы (листовые пластинки на стадии начального развития) от 203 деревьев карельской березы (201 – на Заонежской ЛСП, а 2 – на Агробиологической станции Карельского научного центра РАН, расположенной вблизи от г. Петрозаводска). Исследования показали, что в выборке из 201 дерева 132 имеют внешние признаки, свидетельствующие о наличии узорчатой текстуры в древесине. На обоих участках карельской березы преобладают деревья высокоствольной формы роста. При этом на первом участке большинство из них (52%) характеризуется мелкобугорчатым типом поверхности ствола, а на втором – шаровидноутолщенным (37%). По высоте 35-летние деревья превышают 15-летние в 1,7 раза, а по диаметру ствола в 2,5 раза. На основании полученных результатов сформирована база данных, отражающая фенотипические признаки и свойства 203 деревьев карельской березы: наличие/отсутствие «узорчатости» в древесине, форма роста растений (высоко-, короткоствольная, кустообразная или кустарниковая) и тип поверхности ствола (шаровидноутолщенный, мелкобугорчатый, ребристый или без признаков «узорчатости»). В нее включены также данные по высоте и диаметру ствола. Учитывая низкую конкурентоспособность карельской березы на ранних этапах развития (по сравнению не только с другими древесными, но и травянистыми растениями), проведен анализ видового состава живого напочвенного покрова, сформировавшегося на двух разновозрастных участках, который будучи важным компонентом биоценоза, оказывает существенное влияние на рост и развитие всех произрастающих здесь деревьев. Установлено, что различия по видовому составу живого напочвенного покрова, выявленные между 15- и 35-летними насаждениями, обусловлены прежде всего разной длительностью его формирования, количеством поступавшего в почву опада березы (и травяно-кустарничковой растительности), а также отчасти видовым составом растительности, произрастающей на сопредельной с ними ненарушенной лесной территории. В ходе выполнения проекта обобщены и систематизированы наиболее важные собственные и литературные данные, полученные при изучении карельской березы преимущественно за последние 20–30 лет. Приведены многочисленные факты в пользу того, что узорчатая древесина, которая является главным отличительным признаком карельской березы, устойчиво наследуется в семенном потомстве (при контролируемом опылении) и сохраняется при вегетативном размножении как в естественных, так и искусственно созданных популяциях, а также при ее интродукции и реинтродукции. Отсюда следует, что признак «узорчатая древесина» детерминирован генетически, хотя вопрос об особенностях его наследования пока остается открытым. Для каждого растения в экспериментальной выборке 203 деревьев была выделена высококачественная ДНК для дальнейшей подготовки библиотек для секвенирования. Качество препарата ДНК оценивали визуально путем электрофореза в агарозном геле, а также с помощью спектрофотометра на основании показателей отношения поглощения волн в диапазонах 260/280 нм и 260/230 нм. В результате проведенных лабораторных работ были получены две библиотеки для RADseq секвенирования, каждая из которых содержала по 96 образцов ДНК изучаемых растений. Концентрация библиотеки №1 составила 76,2 нг/мкл, библиотеки №2 – 49,4 нг/мкл. Размер фрагментов составил 650-700 пн. На отчетном этапе проекта был осуществлен пилотный запуск Illumina MiSeq для пробной библиотеки из 12 образцов березы, для подтверждения качества созданных библиотек и их пригодности для целей секвенирования. Полученные показатели свидетельствует о хорошем качестве полученных библиотек и отсутствии контаминации. Таким образом, библиотеки для секвенирования 192 генотипов карельской березы готовы к запуску на Illumina, запланированного на следующем этапе проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Карельская береза (Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) Hämet-Ahti), обладающая узорчатой древесиной, широко известна в мире и используется как декоративный отделочный материал для изготовления мебели и предметов интерьера. Ценность древесины карельской березы настолько велика, что она продается на вес, а не по объему, как это делается для остальных древесных пород. Возможность плантационного выращивания карельской березы вызывает большой интерес со стороны промышленности, и примеры создания таких плантаций уже имеются за рубежом, например, в Финляндии. Проблема плантационного выращивания карельской березы состоит в том, что даже при контролируемом опылении деревьев с явно выраженным наличием узорчатой древесины в семенном потомстве наблюдается расщепление признаков. При этом, визуальное проявление «узорчатости» можно ожидать у деревьев не ранее 8-летнего возраста. При оптимальных условиях произрастания первые косвенные признаки, наплывы и утолщения у основания боковых побегов – могут проявиться в возрасте 2–3 лет. Эффективные методы ранней диагностики «узорчатости» у деревьев карельской березы представляют большой практический интерес. Согласно ботанической номенклатуре карельская береза до сих пор считается разновидностью березы повислой. Вопрос наследования и генетической детерминации узорчатой текстуры древесины у карельской березы дискутируется с начала прошлого века. Однако только недавно были опубликованы экспериментальные свидетельства о том, что признак узорчатой древесины может быть моногенным. Современные высокопроизводительные технологии генотипирования и разработанные алгоритмы поиска полногеномных ассоциаций (GWAS) позволили в рамках текущего проекта сделать следующий шаг в изучении молекулярно-генетических механизмов формирования фенотипа узорчатой древесины у карельской березы. В результате выполнения работ отчетного этапа 192 дерева, полученные от скрещивания двух пар родителей с «узорчатым» и «безузорчатым» фенотипом, были генотипированы методом RADseq с использованием Illumina NovaSeq 6000. После процедуры фильтрации 9,107,446 парно-концевых прочтений длиной 150 пн были выровнены на референсный геном березы повислой. Необработанные данные высокопроизводительного секвенирования были размещены в базе данных Sequence read archivе под номером PRJNA997794 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA997794). В результате проведенного генотипирования выявлено 37,045 полиморфных SNP-маркеров, которые были использованы для дальнейшего анализа популяционной структуры изучаемой выборки. Проведение поиска ассоциаций (GWAS – genome-wide association study) между фенотипом «узорчатость древесины» и выявленными SNP-маркерами производилось с помощью биоинформатических пакетов GAPIT на языке программирования R. Для картирования генетических локусов, ассоциированных с изучаемым фенотипом, были тестированы несколько различных методов, в том числе GLM, MLM, CMLM, FarmCPU, SUPER. 8 из 37,045 протестированных SNP были признаны значимыми после поправки на множественное тестирование. При этом все SNP, достоверно ассоциированные с признаком, оказались локализованы в едином интервале хромосомы 10, протяженностью 1,2 млн пн, где, предположительно, располагаются гены-кандидаты, отвечающие за формирование узорчатой древесины. В процессе валидации одного из выявленных SNP-маркеров (S10_3465040), объясняющего самый высокий процент наблюдаемой изменчивости (56,28%), были выявлены прилегающие к этому SNP вставки-делеции длиной 2, 13 и 54 нуклеотидов. Делеция в 54 нуклеотидов эффективно детектируется с помощью простой ПЦР, и в изучаемой выборке она оказалась сцепленной с фенотипом «узорчатости». Для 174 деревьев из 190, тестированных с помощью ПЦР на наличие этой делеции (92%), маркерная диагностика совпала с фенотипической оценкой. По нашим сведениям, это первый молекулярный маркер, предложенный для идентификации генотипов карельской березы с узорчатой древесиной. ПЦР-маркеру присвоено название BpCW1 (Betula pendula curly wood) и зарегистрирована Заявка № 2023122806/10(050236) на изобретение «BpCW1 - молекулярный маркер для выявления генотипов карельской березы на ранних стадиях развития». Детальные описания процедуры выявления SNP-маркеров, сцепленных с фенотипом карельской березы, а также маркера BpCW1 представлены в статье, сданной в печать и предварительно опубликованной в качестве препринта на сайте bioRxiv: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.11.07.566062v1.