Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках продолжающейся реализации проекта в 2022 году были получены новые значимые результаты. В частности, была разработана, изготовлена и протестирована экспериментальная установка для осуществления проточного микрофлюидного синтеза рентгеновских нанолюминофоров с регулируемым размером частиц и контролируемыми сцинтилляционными свойствами при возбуждении в рентгеновском и УФ-диапазоне. Проточный синтез на основе микрофлюидной технологии, позволяет существенно (на несколько порядков) сократить количество используемых исходных химических реактивов на пути поиска оптимальных параметров синтеза нанофосфоров и последующего получения нанокомпозитов для рентгеновской фотодинамической терапии в онкологии. Контроль размера частиц и люминесцентной активности реализован в виде дополнительных модулей, позволяющих осуществлять оценку гидродинамического размера частиц на основе метода динамического рассеяния света DLS (dynamic light scattering) в режиме in situ для получаемого на выходе из системы проточного синтеза образца. Аналогичным образом реализована система «обратной связи» позволяющая проводить контроль флуоресценции синтезируемых продуктов в режиме «онлайн». С целью оценки работоспособности системы в отчетном периоде были проведены тестовые эксперименты по синтезу нанолюминофоров LaF3:Tb при различных температурах (которая, как было показано нами по результатам классических гидротермальных синтезов оказывает существенное влияние на усредненный размер формируемых НЧ). Также были проведены работы по получению нанолюминофоров BaGdF5, допированных с различной концентрацией ионами Tb и Eu (путем регулирования скоростей потоков прекурсоров Gd и Eu/Tb), и проведению дальнейшего контроля их сцинтилляционных свойств. Полученные результаты подтвердили сходные тенденции увеличения среднего размера частиц НЧ LaF3:Tb при повышении температуры, а также модификации интенсивности флуоресценции НЧ BaGdF5:Tb/Eu при изменении скоростей потоков прекурсоров Gd и допирующих элементов (Eu/Tb). В рамках биомедицинской части проекта были продолжены систематические исследования биораспределения различных разрабатываемых нанокомпозитов с помощью in vivo микро-КТ экспериментов, а также их распределения в тканях внутренних органов и патологических опухолевых тканях при различных путях введения композитов и последующем посмертном анализе. Полученные результаты демонстрируют определенные различия в биораспределении композитов на основе НЧ LaF3:Tb в зависимости от размера частиц (30 нм., и 150 нм.), указывая на то, что малые НЧ дольше циркулируют в кровеносной системе мышей линии balb/c в течение первых суток после внутривенного введения. Однако для композитов на основе НЧ GdF3:Tb с различной морфологией частиц или образцов нанокомпозитов LaF3:Tb с модификацией поверхности биосовместимыми компонентами - цитратами или олеиновой кислотой существенных различий в биораспределении не наблюдалось. Было показано, что даже при длительном наблюдении (до 5 недель) после внутривенного введения различных разрабатываемых в рамках реализации проекта нанокомпозитов признаков токсикологического отравления у исследуемых мышей не наблюдалось. Однако посмертный анализ биологической ткани печени, селезенки, а также опухолевой ткани (после внутриопухолевой инъекции) с помощью лабораторной микро-КТ, синхротронной томографии, а также рентгено- флуоресцентного анализа с микро-фокусировкой выявил значительное остаточное количество НЧ в тканях внутренних органов животных при внутривенном введение образцов. В частности, визуализация, выполненная посмертно с помощью микро-КТ с увеличенным временем сбора данных и синхротронная томография позволила визуализировать микрометровые конгломераты НЧ внутри печени и селезенки, в то время как элементное картирование, выполненное с помощью рентгенофлуоресцентного анализа, подчеркивает, что распределения тяжелых элементов, (таких как La, Gd, Tb, Eu), идентичны распределению Fe, в то время как легкие элементы (P и S) распределены существенно более равномерно.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
По итогам работы по проекту в 2023 году было получено несколько важных результатов фундаментального и прикладного характера. Прежде всего, команда проекта разработала прототип и успешно создала установку для микрофлюидного проточного синтеза, позволяющую в независимом режиме управлять скоростями подачи реактивов в четырех каналах системы, варьируя скорости потоков в диапазоне от 0,1 мкл/сек до 300 мкл/сек. Такое точное манипулирование потоками позволило, например, провести синтез наночастиц рентгеновских люминофоров с очень небольшим процентным содержанием допирующих редкоземельных элементов, подаваемых в микрофлюидные реакторы со скоростью потока всего 0,5 мкл/сек. Авторы также реализовали возможность режима синтеза на основе машинного обучения (ML), когда алгоритм предварительно обучается на наборе данных, состоящем из распределений спектральной плотности, и наборе дескрипторов синтеза, в основном состоящем из набора скоростей потока для различных каналов в микрофлюидной установке. Таким образом, такой режим позволяет найти комбинацию потоков реагентов, которая удовлетворяет желаемым оптическим свойствам синтезированных наночастиц (НЧ), контролируемыми in situ при возбуждении рентгеном в режиме XEOL спектроскопии или контролируемым in situ при возбуждении лазером в УФ-диапазоне в режиме регистрации выхода фотолюминесценции. В качестве доказательства концепции мы приводим результаты эксперимента по микрофлюидному синтезу BaGdF5:Tb-Eu, управляемого алгоритмом обратной связи на основе предварительно «обученной» ML модели и нацеленного на получение максимальной спектральной плотности в «красной» области видимого спектра, достигаемой в конечном итоге путем увеличения потока реактива содержащего соли Eu. В результате реализации проекта с помощью микрофлюидного проточного синтеза были получены наночастиц различных рентгеновских люминофоров. На примере НЧ на основе BaGdF5 было показано, что микрофлюидный способ позволяет резко сократить продолжительность термообработки реакционной смеси до 6 мин, сопровождающуюся снижением температуры синтеза до 100 оС, сохраняя кристалличность, монодисперсность и оптические свойства синтезированных НЧ. Синтез НЧ LaF3, легированных ионами Tb3+, также был успешно реализован в микрофлюидном режиме. Влияние скорости потока, состава растворителя и температуры термостатирования полученной реакционной смеси было подробно исследовано. Насколько нам известно, в рамках проекта мы впервые сообщили об одноэтапном микрофлюидном способе получения нанокомпозитных материалов для рентгеновской фотодинамической терапии на основе BaGdF5:Tb и фотосенсебилизатора Бенгальского розового, ответственного за генерацию синглетного кислорода. По результатам работы была опубликована статья в журнале 1-го квартиля (https://doi.org/10.3390/ijms242417159 ) и подана заявка на патент на изобретение, отражающая особенности экспериментальной установки, использованной для одностадийного получения нанокомпозита. В частности, было показано, что коньюгация НЧ и молекул фотосенсибилизатора легко происходит при активном смешивании за счет внедрения на выходе установки микрофлдюидного синтеза дополнительного микрореактора, в котором полученную реакционную смесь дополнительно смешивают с эквивалентным потоком водного раствора фотосенсебилизатора. Чтобы сделать возможным in situ характеризацию оптических свойств синтезированных образцов и оценку усредненного размера частиц с помощью зонда DLS (динамического светорассеяния), несколько совершенно новых проточных ячеек были смоделированы и изготовлены с использованием 3D-печати в рамках технологии цифровой светопроекции DLP и с использованием фотополимера, в качестве основного компонента и стеклянных или кварцевых окошек в зависимости от режима (источника) возбуждения образцов в потоке. Наконец, вновь полученные микрофлюидным путем нанокомпозиты BaGdF5:RB, а также полученные на предыдущем этапе люминесцентные НЧ LaF3 были выбраны в качестве объектов для серии in vitro и in vivo экспериментов, выполненных на различных клеточных линиях, таких как аденокарцинома легкого человека A 549, аденокарцинома HeLa и непатологические фибробласты кожи человека HSF и лабораторных мышах линии balb/c. In vitro эксперименты продемонстрировали умеренную токсичность даже для нанокомпозитов и люминесцентных наночастиц без дополнительной пассивации поверхности. TEM-визуализация клеток A 549 явным образом продемонстрировала захват клетками исследуемых объектов, в то время как отсутствие значительного количества НЧ, прикрепленных к клеточной мембране, позволило использовать эксперименты по проточной цитометрии для в качестве косвенного статистического количественного анализа клеточного поглощения. Наконец, эксперименты по токсичности in vivo с долгим периодом наблюдений продемонстрировали отсутствие каких-либо острых токсикологических признаков на протяжении всего периода наблюдений (3-4 недели), а биораспределение нанокомпозитов BaGdF5:Tb@RB, оцененное методом рентгеновской микро-КТ томографии, позволило выявить необычный характер накопления нанокомпозитов BaGdF5:Tb@RB, заключающаяся в постепенном и существенном снижении концентрации НЧ в печени и селезенке после первой недели наблюдения с последующим неравномерным повторным накоплением агентов в срединной доле печени.