Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На первом этапе, мы подобрали условия для выделения мононуклеарной фракции лейкоцитов крови методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Обнаружили, что центрифугирование в градиенте плотности Ficoll-PaqueTM PREMIUM 1.084 г/см3 дает наибольший выход мононуклеарной фракции – 3x10е8 клеток из 100 мл крови, против 2x10е8 (Ficoll-PaqueTM PREMIUM 1.077) и 1.7x10e8 (ПанЭко фиколл 1,077 г/см3), соответственно. Также, наиболее критичными факторами для успеха выделения являются 1) свежесть донорской крови, и 2) сильное разведение (минимум в 3-4 раза) этой крови буфером 1xD-PBS. Всего было проведено три выделения мононуклеарных клеток от трех разных доноров. На следующем этапе, мы адаптировали и оптимизировали метод выделения чистых моноцитов из мононуклеарной фракции крови с помощью магнитно-активированного клеточного сортинга (МАКС) и набора Pan Monocyte Isolation Kit human (#130-096-537, Miltenyi Biotec, Germany). В этой работе мы использовали негативную селекцию, когда мононуклеары обрабатываются биотинилированными антителами специфичными в отношении поверхностных маркеров, которые не экспрессируются моноцитами. Затем смесь клеток и антител обрабатывается магнитными микрошариками, которые несут на своей поверхности антитела к биотину. Полученная смесь пропускается через намагниченную колонку, и моноциты должны «проскакивать» через нее в элюат. Однако на практике моноциты могут задерживаться на колонке из-за интерференции несвязавшихся антител, которые взаимодействуют с микрошариками и оседают на колонке, или из-за спонтанной или случайной агрегации с лимфоцитами. Кроме того, лимфоциты могут плохо задерживаться на недостаточно большой магнитной колонке и попадать в элюат вместе с моноцитами. Культивирование таких загрязненных моноцитов в условиях ДК-дифференцировки приводило к пролиферации лимфоидных клеток, что сопровождалось образованием массивных клеточных агрегатов. Поэтому были предприняты следующие шаги: 1) мы удаляли несвязавшиеся антитела, что препятствовало образованию «липких» зон концентрированных антител на носителе колонки; 2) разбавляли и пипетировали образец перед нанесением на колонку для минимизации агрегации клеток; 3) использовали более избирательные LD Columns вместо LS Columns (Miltenyi); 4) интенсивно промывали (4x4 мл) колонку для снятия всех неспецефично связавшихся моноцитов с колонки. Было проведено восемь очисток моноцитов на МАКС - колонках. Нам удалось минимизировать потери моноцитов на магнитной колонке, и при этом мы добились практически 100% чистоты моноцитарной фракции. Так как ДК, полученные из моноцитов крови (моно-ДК) в нашем проекте выполняют роль положительного контроля для ДК, получаемых в безсывороточных средах из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), то мы использовали такие же культуральные среды для ДК-дифференцировки моноцитов как и при дифференцировке иПСК. Питательная среда mTeSR1 широко применяется для выращивания плюрипотентных стволовых клеток человека и содержит значительное количество ростового фактора FGF2 (фактор роста фибробластов второй), а также бычий сывороточный альбумин (БСА) и ростовой фактор TGFb (фактор роста опухолей – бета). Среда Stemline II применяется для поддержания культур стволовых клеток крови и гемопоэтических прогениторов, а также для направленной гемопоэтической дифференцировки иПСК. Мы тестировали эти две среды на их пригодность для генерации моно-ДК, и изучали какая среда, или какая смесь 2 сред, будет наиболее оптимальна для дифференцировки моноцитов в ДК. Необходимо отметить, что дифференцировка моноцитов в ДК осуществлялась в присутствии рекомбинантного человеческого (рч) GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), и рчIL-4 (интерлейкин 4). Мы использовали агрегацию незрелых моно-ДК с суммарной фракцией лимфоцитов как критерий, отражающий успешность генерации ДК. При разделении мононуклеаров на МАКС-колонках с набором антител, которые мы использовали в нашей работе, моноциты элюируются свободно, а лимфоциты (В, Т, и НК клетки) задерживаются на колонке в магнитном поле. Эти лимфоциты могут легко сниматься с колонки в отсутствии магнитного поля. Незрелые моно-ДК могут образовывать агрегаты с очищенными лимфоцитами в культуре. Чем лучше моноциты дифференцируются в моно-ДК, тем сильнее происходит агрегация с лимфоцитами (и агрегация самих моно-ДК). В наших экспериментах (всего проведено 2 эксперимента) было найдено, что наиболее интенсивная агрегация происходила в 50% (1:1) mTeSR1 в Stemline II, поэтому мы выбрали эту смесь для дальнейшей работы. В питательную смесь mTeSR1 в Stemline II (1:1) добавляли рчGM-CSF (50 нг/мл) и рчIL-4 (50 нг/мл) и в эту среду высаживали хорошо очищенные моноциты. Мы затем тестировали эффективность дифференцировки моноцитов крови в смеси 1:1 этих двух сред. Через 1 неделю, большинство клеток в культуре обладало характерной для ДК морфологией и подвижностью. Анализ экспрессии поверхностных маркеров с помощью проточной цитометрии показал характерный фенотип ДК после двух недель дифференцировки. Двухнедельные моно-ДК обладали способностью агрегировать с суммарными лимфоцитами крови, что является одной из функциональных характеристик ДК. Таким образом, мы подобрали оптимальные условия для очистки и дифференцировки моноцитов крови в моно-ДК в безсывороточной культуральной среде, и выполнили задание по проекту на 2022 год. Дифференцировка моноцитов крови в смеси mTeSR1/Stemline II (1:1) в присутствии цитокинов GM-CSF и IL-4 происходила с потрясающей эффективностью. Уже через 24 часа инкубации большая часть моноцитов приобретала характерную для ДК морфологию. Через 2 недели, проточная цитометрия неизменно подтверждала, что моноциты полностью дифференцировались в ДК с фенотипом CD14-CD45+HLA-DR+. В связи со значительными логистическими проблемами в 2022 году, и серьезным нарушением поставок из Китая из-за нулевой терпимости к КОВИДу, мы инициировали работу, которая планировалась на 2023 год, а именно культивирование, размножение и дифференцировка иПСК. Член-корреспондент РАН, М.А. Лагарькова (Федеральный Научный и Клинический Центр Физико-Химической Медицины Федерального Медико-Биологического Агентства, Москва) любезно предоставила нам две линии иПСК: IPS12 и HUVOS3. В прошедшем году мы адаптировали и оптимизировали выращивание этих двух линий на витронектине в среде mTeSR1. Выращивание на витронектине позволяет улучшить пролиферативный статус иПСК, а также способность этих клеток образовывать эмбриональные тела (ЭТ), которые используются на начальных стадиях гемопоэтической дифференцировки иПСК. Мы размножили две линии иПСК для последующей работы, проверили эти линии на заражение микоплазмой и кариотипировали клетки, подтвердив их нормальный статус. Нами также был модифицирован протокол гемопоэтической дифференцировки по методу Филоненко и др., 2021 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34342123/) с использованием формирующих матриц AggreWell400. В течении 2-3 месяцев, методом проб и ошибок, нам удалось найти способ формирования ЭТ без центрифугирования матриц, что значительно улучшает выживаемость иПСК в ходе гемопоэтической дифференцировки. Также, мы адаптировали более дешевый и стабильный препарат коллагена (STEMCELL Technologies) для эффективной гемопоэтической дифференцировки. В ходе работы, были тестированы 12 разведений коллагена (3 mg/mL) обнаружено, что интенсивный гемопоэз индуцируется на коллагеновом покрытии, полученном при концентрации белка 15 мкг/мл. До конца года планируется очистка иПСК-моноцитов с помощью МАКС. В итоге мы успешно оптимизировали 1) выделение мононуклеарной фракции периферической крови; 2) очистку моноцитов крови с помощью магнитно-активированного клеточного сортинга (МАКС); 3) выращивание иПСК на витронектине в среде mTeSR1; 4) генерацию ЭТ на матрице AggreWell400 без центрифугирования; 5) использование более дешевого и стабильного коллагена для гемопоэтической дифференцировки иПСК.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 году была создана оригинальная технология генерации дендритных клеток (ДК) из плюрипотентных стволовых клеток человека (чПСК) в безсывороточных условиях клеточной культуры и без антибиотиков, что наиболее соответствует условиям для использования дендритных клеток в иммунотерапии рака. Метод работает хорошо как с репрограммированными чПСК, так и эмбриональными стволовыми клетками человека (чЭСК). Протокол был создан на основе метода безцитокиновой гемопоэтической дифференцировки с использованием прикрепленных к нативному коллагену эмбриоидных телец (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34342123/). Всего, с одной 6-луночной планшеты дифференцированных чПСК стабильно собирается не менее 5×107 ДК. При этом изначальное количество чПСК на день 0 составляет 1×106 клеток. Полученная суспензия на 90-95% состоит из ДК, остальные 5-10% представлены моноцитами и макрофагами. Пересев чПСК-ДК суспензии в новый культуральный флакон позволяет практически полностью удалить макрофагальные загрязнения. чПСК-ДК отличаются относительно малыми размерами, небольшим количеством включений, нерегулярной и изменчивой формой. ДК являются полуприкрепленными, обладают значительной мобильностью, проявляя амебоидный тип движения. Незрелые ДК практически не пролиферируют, однако могут поддерживать жизнеспособность длительное время, без заметного апоптоза и падения численности. чПСК-ДК активно фагоцитируют и обладают значительной иммуномодулирующей активностью в смешанной лимфоцитарной реакции (MLR, mixed lymphocyte reaction), что приводит к стимуляции активной пролиферации преимущественно CD4+ T-хелперов. Фенотип неактивированных чПСК-ДК определен как СD1a-CD14-CD45+CD11clowCD86+CD83-. Низкий но отчетливый уровень экспрессии CD11c у всех клеток популяции свидетельствует о том, что полученные ДК относятся к типу кДК1. Однако уровень экспрессии HLA-DR, молекулы главного комплекса гистосовместимости II типа, у чПСК-ДК низок (около 1.5%), что характерно для незрелых ДК. Также чПСК-ДК секретируют небольшое количество IL-12, которое не увеличивается при стимуляции с помощью про-воспалительных цитокинов, простагландина PGE2 и липолисахаридов (LPS) E. coli и Salmonella enteritidis. Также, добавление про-воспалительных цитокинов IL-1β, IFNγ, TNFα, и простагландина PGE2 к чистым популяциям чПСК-ДК не могли стимулировать секрецию TNFα и экспрессию HLA-DR на поверхности клеток. Такие данные свидетельствуют о том, что гемопоэтическая дифференцировка чПСК приводит к образованию кДК1 фетального типа. Однако добавление этих цитокинов и PGE2 вмеcте с лизатом клеток рака щитовидной железы (тип Bethesda 6) привело к индукции экспрессии HLA-DR на поверхности ДК, то есть к активации ДК, подобно активации моно-ДК белками теплового шока (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11673488/). Обнаружена экспрессия IRF8, IRF4, BATF3, ZBTB46, ID2 и SPI1 в чПСК-ДК с помощью метода Обратной Транскрипции-Полимеразной Цепной Реакции (ОТ-ПЦР). Также найдено, что полученные чПСК-ДК содержат значительные количества транскриптов гена XCR1, что однозначно свидетельствует о принадлежности наших чПСК-ДК к группе кДК1. С целью моделирования эффекта стимуляции анти-опухолевой активности иммунных клеток, чПСК-ДК были подсажены к культуре раковых клеток щитовидной железы. Анализ экспрессии клеточных маркеров после ко-культивирования показал, что живые раковые клетки эффективно активируют чПСК-ДК, стимулируя интенсивную экспрессию HLA-DR. Появляется уникальная популяция клеток с фенотипом СD11clowCD45lowHLA-DRhighCD14─, что соответствует фенотипу активированных ДК. Эти данные показывают, что чПСК-ДК, несмотря на свой фетальный тип, способны активироваться DAMP-онкоантигенами, что подтверждает целесообразность использования этих клеток для иммунотерапии раковых заболеваний.