КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-15-20037

НазваниеГенетический контроль дегенерации поясничных межпозвонковых дисков

РуководительАксенович Татьяна Иосифовна, Доктор биологических наук

Прежний руководитель Цепилов Яков Александрович, дата замены: 17.01.2023

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук", Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2022 г. - 2024 г.

Конкурс№66 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (региональный конкурс).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-402 - Медицинская генетика

Ключевые словаПолногеномное исследование ассоциаций; генетика; геномика; функциональная геномика; количественная генетика; RNA-seq; большие данные; дегенерация межпозвонковых дисков; дорсалгия; транскриптомика

Код ГРНТИ34.23.37, 34.03.23, 34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Дегенерация поясничных межпозвонковых дисков (ДПМД) является одним из основных факторов риска развития хронической боли в спине - дорсалгии. Социальная и экономическая значимость дорсалгии очень высока. Ограничение работоспособности, а также временная и стойкая утрата трудоспособности при дорсалгии превышают такие же показатели при других заболеваниях, а лечение, учитывая интермиттирующий характер заболевания, не всегда приносит желаемый результат. Несмотря на относительно высокую (до 74%) наследуемость ДПМД, на данный момент о генетическом контроле ДПМД известно немного. Изучение механизмов формирования и поиск факторов риска ДПМД необходимы для получения новых знаний об этиологии и патофизиологии этого процесса. Целью этого проекта является поиск новых генов и биологических путей, вовлеченных в контроль дегенерации поясничных межпозвонковых дисков человека. Для достижения поставленной цели нами будут решаться три основные задачи. Во-первых, будет создан биобанк образцов крови, плазмы и тканей межпозвонковых дисков на основе выборки пациентов с различной степенью ДПМД (не менее 700 человек). Во-вторых, будут найдены участки генома, вариация которых влияет на риск развития и/или прогрессии ДПМД. В-третьих, будут установлены наиболее вероятные биологические механизмы влияния найденных вариаций на развитие ДПМД. Для решения первой задачи, в сотрудничестве с двумя крупнейшими в области ортопедии федеральными клиническими центрами - Новосибирским научно-исследовательским институтом травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна (Новосибирск) и Национальным медицинским исследовательским центром травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова (Москва), мы сформируем выборку не менее 700 пациентов с различной степенью ДПМД, для которых будут доступны образцы крови, лучевые изображения поясничного отдела позвоночника (МРТ), клинические и социодемографические данные. Каждое изображение будет обработано квалифицированными специалистами согласно разработанным протоколам для получения количественных характеристик, отражающих степень проявления ДПМД. Для части пациентов будет доступен интраоперационный материал фрагментов межпозвонковых дисков, который будет использован для анализа генной экспрессии. Часть образцов (не менее 384) будет генотипирована с помощью полногеномных SNP-чипов. Для решения второй задачи будет проведено масштабное полногеномное исследование ассоциаций (ПГИА, в англоязычной литературе – GWAS) с использованием разработанных, в том числе нами, современных статистических и вычислительных методов. В результате будут найдены участки генома, значимо ассоциированные с ДПМД. Мы проведем мета-анализ результатов нашего ПГИА с предыдущими результатами ПГИА 2013 года, проведенного другой исследовательской группой на европейской популяции. Таким образом, полногеномное исследование ДПМД, которое мы проведем в этом проекте, станет самым крупным в мировом масштабе исследованием на европейской популяции. Задача установления биологических механизмов влияния найденных генетических вариантов на риск возникновения ДПМД будет решаться с применением методов вычислительной функциональной геномики. Набранный интраоперационный материал фрагментов межпозвонковых дисков будет использован для измерения транскриптома и далее будет интегрирован с полученными нами данными об ассоциациях ДПМД. Наличие интегрированных данных позволит исследовать тканеспецифическую регуляцию экспрессии и ко-экспрессии генов в ассоциированных регионах и, таким образом, установить сети генов, осуществляющих регуляцию процессов, ведущих к увеличению риска возникновения ДПМД. Таким образом, научная значимость предлагаемого нами комплексного проекта состоит в том, что он позволит получить новые знания о биологических механизмах, вовлеченных в патогенез ДПМД. Актуальность и практическая значимость нашего проекта определяется тем, что ДПМД является одним из основных факторов риска возникновения дорсалгии - ведущей причины нетрудоспособности людей зрелого и пожилого возрастов. Отличительными характеристиками предлагаемого исследования являются его масштаб и комплексный подход, позволяющий объединять вновь полученные и существующие знания в различных областях генетики, геномики и транскриптомики для получения принципиально новой информации о механизмах, вовлеченных в патогенез ДПМД.

Ожидаемые результаты
Практическая значимость нашего проекта определяется тем, что ДПМД является одним из основных факторов риска возникновения дорсалгии - причины номер один нетрудоспособности людей зрелого и пожилого возрастов по всему миру. Дорсалгия является одним из главных клинических проявлений дегенеративного заболевания межпозвонковых дисков. В мировом масштабе она занимает второе место по распространенности среди причин обращения к врачу и третье - среди причин проведения операции. В странах Запада экономические издержки общества, вызванные дорсалгией, оцениваются в 1-2% от национального валового продукта. При этом частота встречаемости ДПМД (одной из основных причин дорсалгии) в популяции чрезвычайно высока - до 90% среди людей старше 50 лет, а по некоторым данным, среди лиц старшего возраста и вовсе нет ни одного человека без ДПМД. В совокупности эти факты указывают на значительное социально-экономическое влияние ДПМД на жизнь общества и обусловливают необходимость изучения биологических основ данной патологии для разработки подходящих методов лечения. Данный проект направлен на получение фундаментальных знаний, ориентированных на переход к высокотехнологичному здравоохранению и персонализированной медицине. Целью проекта является идентификация новых генов и биологических путей, вовлеченных в формирование ДПМД. Функциональная роль выявленных генов будет также изучена в рамках этого проекта. Это значительно расширит представления о генетической архитектуре ДПМД, будет способствовать систематизации накопленных разнородных знаний о ДПМД из таких отраслей биологии, как геномика и транскриптомика, и позволит ответить на ряд фундаментальных вопросов о патогенезе ДПМД. Результаты проекта будут уникальными и значимыми в мировом масштабе, поскольку, во-первых, будет набрана достаточно крупная по международным стандартам выборка, которая будет включена в крупнейший мета-анализ данных ПГИА ДПМД; и, во-вторых, планируемый анализ данных будет основан на интегративном подходе, который позволит объединить вновь полученные и существующие знания из различных областей биологии для получения принципиально новой информации о биологических механизмах, вовлеченных в патогенез ДПМД. Результатами нашей работы будут не только фундаментальные новые знания об этиологии ДПМД, но и кандидатные биомаркеры и терапевтические мишени. В практическом плане наша работа может внести вклад в создание более совершенных методов прогнозирования течения ДПМД, например, оценки риска развития её тяжелой формы. В настоящее время молекулярно-генетические и клеточные технологии активно внедряются в практику для терапии дегенеративного заболевания межпозвонковых дисков. В частности, все большее внимание уделяется развитию молекулярно-таргетной и генной терапии, направленных на замедление дегенерации и восстановление тканей диска вплоть до здорового состояния. Полученные в нашем проекте знания могут внести вклад в разработку новых малоинвазивных методик лечения дегенеративных заболеваний позвоночника. Таким образом, в долгосрочной перспективе, на основе полученных нами результатов могут быть созданы новые наукоемкие разработки, продукты и услуги, отвечающие национальным интересам Российской Федерации и необходимые для повышения качества жизни населения, что обусловливает общественную значимость данного проекта. Не менее важным результатом будет создание российского биобанка. Помимо изучения ДПМД, данный биобанк потенциально может быть использован и для других генетических исследований, так как будет обладать уникальными данными по генотипированию по большому числу маркеров. Создание российской когорты и ее участие в совместных международных исследованиях увеличит присутствие российских выборок в мировых генетических исследованиях. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, будут представлять большой интерес для научного и медицинского сообщества и будут опубликованы в ведущих международных рецензируемых научных журналах, таких как PAIN, PLOS Genetics, Human Molecular Genetics.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Дегенерация межпозвонкового диска - естественный процесс старения, прогрессирующий с каждым годом. Однако дегенерация диска может быть инициирующим фактором развития дегенеративного заболевания позвоночника, и это уже не нормальный процесс старения, а болезнь, которая имеет клиническую симптоматику. Дегенеративные заболевания позвоночника являются лидирующей причиной временной нетрудоспособности взрослого населения. При этом все виды лечения - консервативные и хирургические - являются симптоматическими, которые при всём своем прогрессивном развитии не влияют на этиопатогенез заболевания. Основным элементом изучения первопричины дегенерации межпозвонкового диска и последующего развития дегенеративного заболевания позвоночника является выявление молекулярно-генетических механизмов и путей, контролирующих дегенерацию диска. Для проведения такого рода исследований нами был разработан протокол по формированию биобанка пациентов с дегенерацией поясничных дисков разной степени выраженности, на основе которого будет проведен комплексный анализ данных для выявления молекулярно-генетических аспектов дегенерации межпозвонковых дисков. В соответствии с разработанным протоколом выполняется сбор образцов (клинических и биологических данных) на базе Новосибирского НИИТО. Планируется открытие второй клинической базы (НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова). Отработана технология по сбору образцов. За отчетный 2022 год в исследование было включено 64 пациента. Для 40 из них в полном объеме собраны клинические данные, данные МРТ поясничного отдела позвоночника, биологические образцы (кровь и плазма). Для остальных участников сбор данных и биологического материала продолжается. Все материалы переданы на долгосрочное хранение. Фенотипические данные, определяемые по МРТ изображениям поясничного отдела позвоночника, включают в себя все наиболее распространенные признаки дегенеративных изменений позвоночника, позволяющие всесторонне оценить выраженность заболевания. Используемые классификации и шкалы имеют высокую надежность и воспроизводимость. Таким образом, фенотипы, полученные в соответствие с данным протоколом сбора фенотипов, могут быть без труда проанализированы и интерпретированы. Сформирована электронная база клинических и фенотипических данных для 341 пациента, позволяющая вести учет данных, отбирать и анализировать необходимую информацию. Протокол проведения фундаментального исследования и формирования биобанка был одобрен и опубликован в международном высокорейтинговом журнале PLOS One (DOI: 10.1371/journal.pone.0267384). Также опубликован протокол выделения РНК из ткани межпозвонкового диска (doi: 10.3390/cells11223578. PMID: 36429007). Для 144 собранных образцов крови было проведено генотипирование с помощью ДНК-микрочипов. Для полученных данных генотипирования был проведен контроль качества в соответствии с международными рекомендациями. Контроль качества прошли 132 образца и 441,125 SNP. Число маркеров в данных генотипирования было увеличено до 4,869,039 SNP с помощью импутации референсной панелью TOPMed v2 (число маркеров указано после фильтрации по качеству импутации > 0.7 и частоте минорного яллеля > 10%). Для дополнительного контроля качества фенотипических и генотипических данных после импутации были получены полигенные оценки роста и индекса массы тела участников когорты RuDDs. Эти оценки были сопоставлены с реальными значениями признаков в выборке с помощью регрессионного анализа и подсчета корреляций. Показано, что полигенные оценки роста и индекса массы тела имеют статистически значимый эффект на соответствующий фенотип и коррелируют с ним. Еще 192 новых образца были отправлены на генотипирование в 2022 году. Помимо генотипирования образцов крови, в 2022 году было проведено экспрессионное профилирование 11 образцов интраоперационного материала с помощью технологии RNA-Seq, на 4 из них был проведен развернутый анализ качества. Данный анализ показал высокое качество транскриптомных данных и подтвердил, что более чем 70% клеточного состава образцов представлено хондроцитами трех типов. Таким образом, было показано, что собранные образцы и полученные на них транскриптомные данные пригодны для проведения анализов экспрессии, специфичных для межпозвонковых дисков. Все задачи на 2022 год были выполнены.

Публикации

1. Белоногова Н.М., Кириченко А.В., Фрейдин М.Б., Вильямс Ф., Сури П., Аульченко Ю.С., Аксенович Т.И., Цепилов Я.А. Non-coding rare variants in PANX3 are associated with chronic back pain Pain, На данный момент вышла электронная версия (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1097/j.pain.0000000000002781

2. Иванов А.А., Леонова О.Н., Вибе Д.С., Крутько А.В., Гридина М.М., Фишман В.С., Аульченко Ю.С., Цепилов Я.А. и Голубева Т.С. Method for the Isolation of “RNA-seq-Quality” RNA from Human Intervertebral Discs after Mortar and Pestle Homogenization Cells, 11(22), 3578 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/cells11223578

3. Свищева Г.Р., Тийс Е.С., Елгаева Е.Е., Феоктистова С.Г., Тиммерс П., Шарапов С.Ж., Аксенович Т.И., Цепилов Я.А. A Novel Framework for Analysis of the Shared Genetic Background of Correlated Traits Genes, 13(10):1694 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/genes13101694

4. Иванов Артемий Александрович, Цепилов Яков Александрович, Голубева Татьяна Сергеевна Cпособ получения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека -, 2022130210 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Дегенерация межпозвонкового диска - естественный процесс старения, прогрессирующий с каждым годом. Однако дегенерация диска может быть инициирующим фактором развития дегенеративного заболевания позвоночника, и это уже не нормальный процесс старения, а болезнь, которая имеет клиническую симптоматику. Дегенеративные заболевания позвоночника являются лидирующей причиной временной нетрудоспособности взрослого населения. При этом все виды лечения - консервативные и хирургические - являются симптоматическими, которые при всём своем прогрессивном развитии не влияют на этиопатогенез заболевания. Основным элементом изучения первопричины дегенерации межпозвонкового диска и последующего развития дегенеративного заболевания позвоночника является выявление молекулярно-генетических механизмов и путей, контролирующих дегенерацию диска. Для проведения такого рода исследований нами был разработан протокол по формированию биобанка пациентов с дегенерацией поясничных дисков разной степени выраженности, на основе которого будет проведен комплексный анализ данных для выявления молекулярно-генетических аспектов дегенерации межпозвонковых дисков. В 2023 году биобанк был пополнен данными 285 пациентов, включая их фенотипические, клинические данные и биологические образцы .Была открыта вторая клиническая база в НМИЦ ТО им. НН Приорова, г. Москва. За весь срок проекта в биобанк на обеих клинических базах включены данные и биообразцы 704 пациентов. По разработанному в прошлом году протоколу была выделена РНК из двадцати образцов. Был проведен анализ RNA-seq, и получены парные прочтения секвенирования для пяти образцов. Для 16 образцов (включая одиннадцать образцов, полученных в прошлом году) был проведен контроль качества, выравнивание прочтений на референсный геном и квантификация прочтений, картированных на экзоны генов. Анализ клеточного состава с использованием деконволюции выявил высокую долю клеточных типов, характерных для тканей межпозвоночных дисков. Был проведен предварительный анализ дифференциальной экспрессии на основе пятнадцати образцов, из которых пять образцов получены из тканей пациентов, являющихся “условно здоровыми по ДПМД". Было выявлено 195 белок-кодирующих ДЭГ: уровень их экспрессии значительно возрастает у 174 генов и снижается у 21 гена у пациентов с ДПМД по сравнению с условно здоровыми пациентами по ДПМД. Среди выявленных ДЭГ были найдены гены, для которых имеются данные об ассоциации с развитием ДПМД. Нами был проведен контроль качества всех генотипов, полученных ранее. В результате остался 251 образец с данными по 469,981 SNP, удовлетворяющих заданным критериям качества. Далее нами также была проведена импутация данных генотипов, прошедших контроль качества, с использованием веб-сервиса TOPMed Imputation Server. Применен на практике новый подход, разработанный нами в прошлом году в рамках данного проекта. Этот подход позволяет увеличить мощность анализа ассоциаций путем совместного анализа нескольких генетически коррелированных признаков, и идентифицировать гены, общие для всех этих признаков, и специфичные для каждого из них. Мы использовали этот подход в двух исследованиях. В первом анализировали редкие варианты, полученные полноэкзомным секвенированием, и три фенотипа, относящиеся к боли в спине: хроническая боль в спине, дорсалгия и дегенерация межпозвонковых дисков. Мы показали, что общим для всех этих признаков является ген FSCN3, ассоциированный с болью в спине благодаря LoF вариантам. Второе исследование было посвящено анализу хронической боли разной локализации с помощью импутированных генотипов. Мы идентифицировали пять генов, общих для этих признаков: FOXP2, SLC39A8, MAML3, GABRB2 и TCF20. Эти гены вовлечены в процессы нейрогенеза и функционирование центральной нервной системы. Специфичным для хронической боли в спине оказался ген CHST3, участвующий в дегенерации межпозвонковых дисков. Проведен анализ причинно-следственных связей боли в спине и ассоциированных с ней признаков с помощью анализа менделевской рандомизации. В частности, исследована ее связь с предполагаемыми факторами риска, такими как повышенное артериальное давление и нейротизм. Нами было показано, что повышенное систолическое и диастолическое давление действительно повышают риск развития дорсалгии. В то же время, показано, что дорсалгия является фактором риска для диабета второго типа. Кроме того, мы обнаружили положительную обратную связь между нейротизмом и дорсалгией. Все задачи на 2023 год были выполнены.

Публикации

1. Елгаева Е.Е., Вилльямс Ф., Зайцева О.О., Фрейдин М.Б., Аульченко Ю.С., Сури П., Цепилов Я.А. Bidirectional Mendelian Randomization Study of Personality Traits Reveals a Positive Feedback Loop Between Neuroticism and Back Pain. The Journal of Pain, 24(10):1875-1885 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.jpain.2023.05.012

2. Зоркольцева И.В., Елгаева Е.Е., Белоногова Н.М., Кириченко А.В., Свищева Г.Р., Фрейдин М.Б., Вилльямс Ф., Сури П., Цепилов Я.А., Аксенович Т.И. Multi-Trait Exome-Wide Association Study of Back Pain-Related Phenotypes Genes, 14, 1962 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/genes14101962

3. Сури П., Елгаева Е.Е., Вилльямс Ф., Фрейдин М.Б., Верзун Д.А., Цепилов Я.А. Repurposing Antihypertensive and Statin Medications for Spinal Pain: A Mendelian Randomization Study Spine, 48:1568–1574 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1097/BRS.0000000000004790

4. Сури П., Елгаева Е.Е., Вилльямс Ф., Фрейдин М.Б., Зайцева О.О., Аульченко Ю.С., Цепилов Я.А. Evidence of causal effects of blood pressure on back pain and back pain on type II diabetes provided by a bidirectional Mendelianrandomization study. The Spine Journal, Aug;23(8):1161-1171 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.spinee.2023.04.001

5. Цепилов Я.А., Елгаева Е.Е., Ностаева А.В., Компте Р., Кузнецов И.А., Карссен Л., Фрейдин М.Б., Сури П., Вилльямс Ф., Аульченко Ю.С. Development and Replication of a Genome-Wide Polygenic Risk Score for Chronic Back Pain Journal of Personalized Medicine, 13(6), 977 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/jpm13060977