Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе первого этапа проекта начаты работы по анализу изменений липидома мозга человека при шизофрении и большом депрессивном расстройстве. Исследование предполагает выделение и анализ содержания около 500 липидных соединений в 15 регионах мозга 60 индивидуумов. В связи с масштабом работа на данном этапе основные усилия были направлены на то, чтобы, во-первых, определить конкретные регионы мозга, которые будут исследованы, а во-вторых, протестировать и отработать протоколы выделения и анализа липидных соединений, что в указанных масштабах является довольно нетривиальной задачей. Поскольку литературные данные об изменении липидома мозга в случае данных заболеваний практически отсутствуют, выбор регионов мозга был основан на двух основных подходах. В рамках первого подхода, мы проанализировали литературу определяющие регионы мозг ассоциированные со шизофренией и большим депрессивным расстройством на основании анатомических, молекулярно-биологических и функциональных исследований. В рамках второго подхода, мы проанализировали данные полученных в нашей лаборатории до начало проекта включающие измерения 75 регионов мозга в четырех индивидуумах с диагнозом шизофрения (параноидальная шизофрения) и четырех контрольных индивидуумах. На основании этих анализов, было принято решение протестировать 36 регионов мозга на выборке доноров меньшего размера с целью определить наиболее значимые регионы и в дальнейшем подтвердить гипотез на больших выборках. Среди 36 выбранных регионов 10 являются регионами белого вещества мозга и 26 – серого вещества. Выборка включала по 7 доноров для каждой группы (шизофрения, депрессия и контроль). Для того, чтобы удостовериться в надежности протоколов экстракции и оптимизировать протокол ВЭЖХ-МС анализа, был выполнен пилотный проект, в рамках которого было исследовано 8 регионов мозга 12 доноров (по 6 доноров в двух группах – шизофрения/контроль). В ходе данного проекта протокол ВЭЖХ-МС анализа был модифицирован, что позволило успешно проводить фрагментацию порядка 2500 ионов с различными комбинациями m/z и времени удерживания, а в конечном итоге выполнить аннотацию 705 липидных соединений из 23 липидных классов. На основе полученных данных было показано, что качество образцов мозга позволяет успешно проводить полноценный анализ липидного профиля, подтверждены методики экстракции и масс-спектрометрического анализа, которые будут использованы далее в проекте. Более того, даже на небольшой выборке из 8 регионов и 6 доноров в двух группах были обнаружены статистически значимые изменения между шизофренией и контролем, различающиеся в зависимости от региона мозга. Например, наибольшие отличия были найдены в мозолистом теле (corpus callosum, регион ccbi). На основе отработанных протоколов была успешно произведена вырезка образцов 36 регионов мозга 21 донора. Липидная фракция была выделена и проанализирована. В настоящий момент идет подготовка базы данных, содержащей информацию о липидном составе всех перечисленных образцов, на основании которой в дальнейшем будет выполнен анализ изменений липидома, характерных для шизофрении и большого депрессивного расстройства.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках реализуемого проекта в 2023 году были получены следующие результаты. В первую очередь, был завершен анализ изменений липидного состава мозга при шизофрении и большом депрессивном расстройстве, основанный на измерениях 36 регионов мозга у семи пациентов с диагнозом шизофрения, семи пациентов с диагнозом большое депрессивное расстройство и семи контрольных индивидуумов без диагностированных расстройств мозга. Анализ, основанный на уровнях 616 липидных соединений, выявил значимые различия в уровнях липидов как между образцами мозга пациентов и контрольными образцами, так и между заболеваниями. В частности, показано, что в обоих заболеваниях наблюдается повышение уровня липидов, связанных с нейровоспалительными процессами, снижение уровня липидов, ассоциированных с митохондриями, и резкое повышение уровня свободных жирных кислот. В то время как повышение уровня свободных жирных кислот является общим для обоих заболеваний, сигналы, ассоциированные с нейровоспалением и митохондриями, показали значительные различия. В частности, изменения липидного состава мозга, связанные с нейровоспалением, были гораздо более выражены в коре головного мозга пациентов с большим депрессивным расстройством, чем у пациентов с шизофренией. При этом при шизофрении наблюдалось более сложное распределение сигналов нейровоспаления в коре, включая разницу между префронтальной и височной отделами коры. Одновременно, уровень нейровоспаления в латеральных ядрах миндалины был существенно снижен при большом депрессивном расстройстве по сравнению со шизофренией. В отличие от нейровоспаления, снижение уровня липидов, ассоциированных с митохондриями, было более выражено при шизофрении, особенно в регионах белого вещества. Обнаруженные изменения липидного состава мозга согласуются с данными предыдущих исследований, свидетельствующих о наличии нейровоспалительных процессов, ассоциированных как с депрессией, так и с шизофренией. Также отмечены снижение активности митохондрий и проблемы с энергетическим метаболизмом мозга, ранее упомянутые среди патологических изменений гистологии мозга для обоих заболеваний. Наши результаты предполагают, что изменения митохондриального состава мозга, особенно при шизофрении, не ограничиваются корой больших полушарий, но также характерны для регионов белого вещества. Кроме того, изменения липидов, связанных с нейровоспалением, показывают сложную и отличную картину изменений в двух заболеваниях, возможно связанную с характером проявляемой симптоматики. Отношение между обнаруженными изменениями липидного состава и проявлениями заболеваний открывает новые перспективы для молекулярных исследований мозга, которые будут частично изучены в рамках третьего этапа данного проекта. В дополнение к основному направлению исследования, в 2023 году в рамках проекта мы провели следующие дополнительные исследования. Во-первых, было проведено исследование стабильности липидного состава мозга в зависимости от длительности постмортального интервала. Это исследование было направлено на выявление возможных артефактов изменений липидного состава мозга, обнаруживаемых при заболеваниях, связанных с наличием в некоторых случаях достаточно длительных постмортальных интервалов, достигающих 24 часов. В рамках проекта были проведены исследования липидома образцов мозга человека, а также лабораторных животных - крыс и мышей, взятых с нулевым постмортальным интервалом и, затем, с определенной периодичностью в течение 48 часов. В случае образцов мозга человека, послеоперационный материал был получен от пациентов с диагностированной эпилепсией, не поддающейся медикаментозной терапии. В случае модельных организмов, материал был получен от контрольных животных, использованных для другого проекта, после их вскрытия. Результаты показали высокую стабильность липидного состава тканей мозга на протяжении всего периода измерений для всех биохимических классов липидных соединений, за исключением окисленных жирных кислот. Соответственно, данная работа показала, что изменения липидного состава мозга, обнаруженные в наших исследованиях психиатрических заболеваний, не могут быть объяснены постмортальными артефактами. Во-вторых, был проведен анализ образцов шести регионов белого вещества пациентов с диагностированной параноидальной шизофренией и соответствующих контрольных индивидуумов. Эта работа подтвердила резкое снижение представленности липидов, ассоциированных с митохондриальными мембранами, при шизофрении во всех регионах белого вещества. Дополнительные эксперименты, включающие гистологическое окрашивание митохондрий и прямое выделение митохондриальной фракции, подтвердили данное наблюдение. В то время как дисфункция митохондрий была ранее показана для серого вещества коры больших полушарий, исследования белого вещества ранее не проводились. Наши результаты показывают, что снижение функции митохондрий является важным и существенным характеристическим фактором молекулярных изменений, происходящих в мозге при шизофрении. В-третьих, были проведены тестовые исследования возможности применения методов липидного анализа мозга с пространственным разрешением (spatial lipidomics) для получения молекулярных профилей срезов головного мозга. Методика, используемая для подобных измерений, MALDI-MSI, позволяет, в нашем случае, получать разрешение до 40 микрометров. Работа, проведенная совместно с лабораторией профессора Е.Н. Николаева (Сколтех) по анализу липидного состава срезов головного мозга, включающих серое вещество коры больших полушарий и два независимых проводящих пути в белом веществе, продемонстрировала не только отличия между серым и белым веществом, но и различия между двумя проводящими путями. Это исследование открывает дверь для проведения пространственного анализа липидома здоровых и патологических образцов мозга, что позволит локализовать изменения липидного состава мозга в определенных гистологических и анатомических структурах.