КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 22-15-00292

НазваниеФотопереключаемые флуоресцентные капсулы как новый подход в изучении процессов миграции клеток, их поведения и функций в фундаментальной биомедицине

РуководительСухоруков Глеб Борисович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2022 г. - 2024 г.

Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-106 - Нейробиология

Ключевые словамаркировка единичных клеток, отслеживание, миграция, фотопереключаемые микрокапсулы, стволовые клетки, нейрон, ткань мозга, нейробиология, восстановление мозга

Код ГРНТИ76.03.00

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Необходимость исследования тонких биологических процессов, происходящих в мозге в нормальном и патологическом состояниях на клеточном и субклеточном уровнях потребовало разработки новых сложных оптических методов мечения, детектирования и визуализации как функциональных кластеров, так и отдельных клеток. Серьёзным прорывом в данной области стала разработка трансгенных линий клеток и живых организмов, продуцирующих флуоресцентные фотоконвертируемые белки. Новая технология дала возможность визуализировать и понять ранее неизвестные процессы функционирования и взаимодействия нейронов. Полученные данные позволили по-новому взглянуть на проблему восстановления функций и регенерации нервной ткани. Фотоконвертиртируемые белки позволили следить за процессами, происходящими с нейронами не по статичным (фиксированным) микропрепаратам срезов тканей, а в живых клетках (как в культурах клеток, так и в нативной ткани) в режиме реального времени. Это не только повысило точность получаемых результатов, но и существенно снизило необходимость использования большого количества лабораторных животных в научных экспериментах. Полученные данные стали основанием для разработки новых, более эффективных принципов и подходов в терапии нервной системы. Однако, как любой метод, фотоконвертируемые белки имели и до сих пор имеют ряд существенных недостатков, которые являются причиной продолжающихся исследований. К этим недостаткам можно отнести: склонность фотоконвертируемых белков к деградации, проявление цитотоксичных свойств, склонность к агрегации, недостаточный уровень флуоресценции, невозможность длительного (в течении нескольких дней\недель) отслеживания объектов, выгорание и «разбавление» фотоконвертированного белка при делении клеток. Однако, наиболее значимым недостатком является необходимость генной модификации биологических объектов (отдельных клеток, их культур или организма) для возможности реализации фотомечения. Генная модификация первичных культур клеток, выделенных из пациента, является спорным и достаточно противоречивым вопросом в случае, когда терапия предполагает аутотрансплантацию выделенных и размноженных клеток обратно в организм. При этом, проблема использования генетически-модифицированного живого материала для дальнейшей терапии носит не только объективный медицинский характер, но и субъективный социально-религиозный. В связи с необходимостью устранения описанных недостатков научные группы по всему миру сконцентрировались в двух направлениях решения проблемы: устранение отдельных единичных недостатков конкретных фотопереключаемых белков и поиск альтернативных фотопереключаемых меток на основе наноматериалов и красителей. Исследования, ведущиеся в первом направлении, позволили решить ряд проблем: были получены более стабильные и менее токсичные виды отдельных белков, однако ключевой недостаток – генная модификация, лежащая в основе метода, является не разрешимым ограничением этого метода. Поиск альтернативных фотопереключаемых меток способствовал разработке флуоресцентных фотопереключаемых красителей, однако и у этого метода есть свои недостатки, свойственные и белкам, - значительно ограниченный выбор длины волны для возбуждения, невозможность идентифицировать отдельную клетку среди нескольких помеченных клеток. Кроме того, фотопереключаемые красители и белки не обеспечивают возможность длительного отслеживания из-за постепенного разбавления красителя при делении и выгорания, а также исключают дополнительную прокраску нескольких типов рецепторов (например, антителами), из-за общей прокраски всей клетки и мембраны. В связи с этим, создание принципиально новой фотопереключаемой метки является важной задачей не только для нейробиологии, но и для других отраслей биомедицины. Проведённые нами предварительные исследования показали, что многослойные полимерные капсулы легко захватываются клетками и могут оставаться в них в течении нескольких дней/недель. Микронный размер и яркость капсул с одной стороны, обеспечивает их надёжное детектирование внутри живых клеток, с другой стороны, оставляет возможность прокраски мембраны и цитоскелета дополнительными красителями, флуоресцирующими даже в той же области спектра. Мы показали, что полимерные капсулы, полученные методом гидротермального синтеза в растворе родамина B, обладают способностью необратимого изменения спектра флуоресценции при воздействии на них лазерного излучения определённой длины волны и мощности - фотопереключения [1]. Эксперименты на клеточных культурах свидетельствуют об отсутствии выраженной токсичности, разрабатываемой нами фотопереключаемой метки, при этом она демонстрирует высокий уровень флуоресценции и отличную фотостабильность. Важным преимуществом разрабатываемого метода перед существующими аналогами, является возможность индивидуальной маркировки и последующей идентификации каждой конкретной клетки среди помеченных. Это возможность реализуется за счёт способности клеток захватывать несколько капсул одновременно, что позволяет присвоить клетке индивидуальный цветовой код за счёт комбинации переключенных и непереключенных капсул. Все эти качества делают разрабатываемые нами фотопереключаемые флуоресцентные капсулы перспективными кандидатами для изучения процессов миграции клеток, их поведения и функций в фундаментальной биомедицине. 1. Demina, P. A., Sindeeva, O. A., Abramova, A. M., Prikhozhdenko, E. S., Verkhovskii, R. A., Lengert, E. V., ... Goryacheva I.Yu. & Sukhorukov, G. B. (2021). Fluorescent Convertible Capsule Coding Systems for Individual Cell Labeling and Tracking. ACS Applied Materials & Interfaces, 13(17), 19701-19709. doi: 10.1021/acsami.1c02767.

Ожидаемые результаты
Основным результатом реализации проекта станет принципиально новая, простая и легко доступная технология маркирования единичных клеток с возможностью их длительной идентификации в тканях. На моделях культур клеток нейронального типа, первичных культур клеток (нейроны, стволовые клетки), сфероидах (как моделях первичных опухолей мозга) и срезов ткани мозга будет показана возможность изучения фундаментальных процессов, происходящих с клетками нервной системы на разных уровнях организации живых систем. Полученные результаты будут иметь важное как фундаментальное (изучение поведения и миграции клеток в природных и биоинженерных 3D-матрицах, изучение фундаментальных механизмов и принципов взаимодействия отдельных клеток и их групп в тканях), так и прикладное значение (отбор редких фенотипически стабильных и высокоинвазивных лидерских клеток в популяциях раковых клеток, отбор фенотипически одинаковых клеток в гетерогенных первичных линиях для создания очищенных клеточных линий, отбор и получения клонов наиболее мобильных и жизнеспособных клеток для регенерации тканей и лечения аутоиммунных заболеваний) для нейробиологии и медицины. Разрабатываемый метод длительного (в течении нескольких дней, недель) отслеживания отдельных клеток является ключом к пониманию сложных процессов в центральной нервной системе, таких как миграция прогенеторных клеток, регенерация и восстановление повреждённых участков мозга, взаимодействие между здоровыми и опухолевыми тканями мозга, а также исследования фундаментальных механизмов формирования памяти, патологических и нейродегенеративных процессов в мозге. Возможность решения широкого спектра описанных задач станет важным шагом в модернизации современной медицины, позволит более точно подбирать способы и стратегии лечения различных заболеваний нервной системы. Разрабатываемая технология откроет возможность работы с нулевыми и первыми пассажами первичных культур клеток без необходимости их генной модификации и длительной культивации. Это преимущество перед существующими аналогами представляется особенно значимым в контексте дальнейшего применения стволовых и нейрональных клеток для регенерации тканей или противораковой терапии при аутотрансплантации. Кроме того, разрабатываемая технология мониторинга отдельных биологических объектов в живых системах может быть применена для изучения фундаментальных процессов не только в нейробиологии, но также и в других отраслях биологии и медицины. Конечными продуктами, полученными в ходе реализации проекта, станут биосовместимые высокостабильные флуоресцентные метки нового типа и протоколы их использования в культурах клеток и срезах тканей in vitro.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---