КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-15-00271
НазваниеИсследование патогенетического вклада генетических вариантов с неясным клиническим значением в генах саркомерных белков и генах RAS-сигнального каскада в развитие гипертрофической кардиомиопатии с использованием модели индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и системы редактирования CRISPR/Cas9
РуководительДементьева Елена Вячеславовна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук", Новосибирская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина
Ключевые словаГипертрофическая кардиомиопатия, РАСопатия, сигнальный путь RAS/MAPK, мутация, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, редактирование генов, система CRISPR/Cas9, кардиомиоцит
Код ГРНТИ34.23.27
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний (1 случай на 500 человек). Несмотря на высокую частоту встречаемости, для данного заболевания по-прежнему остается актуальной проблема поиска методов эффективной терапии. До 60% случаев данного заболевания обусловлены генетическими причинами: мутациями в генах, кодирующих белки, вовлеченные в функционирование саркомера. Однако молекулярные механизмы, приводящие от мутаций в саркомерных белках к развитию патологического фенотипа, так и остаются не до конца изученными. ГКМП также может быть одним из проявлений некоторых мультисистемных заболеваний, в том числе так называемых РАСопатий, которые обусловлены мутациями в генах сигнального пути RAS/MAPK, ответственного за пролиферацию, дифференцировку и старение клеток. Внедрение методов высокопроизводительного секвенирования в клиническую практику позволяет выявлять у пациентов все новые мутации в ассоциированных с ГКМП и РАСопатиями генах, но не для всех этих мутаций в настоящее время удается установить клиническое значение.
Целью данного проекта является проверка патогенности четырех мутаций с неясным клиническим значением в генах MYBPC3 и MYH7, кодирующих саркомерные белки, и гене SOS1, относящемся к сигнальному пути RAS/MAPK. С помощью технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и системы редактирования нуклеотидных последовательностей CRISPR/Cas9 для каждой мутации будут получены панели изогенных линий ИПСК, включающие ИПСК здорового донора, ИПСК здорового донора с внесенной мутацией, пациент-специфичные ИПСК и пациент-специфичные ИПСК с исправленной мутацией, что дает возможность оценить влияние мутаций при двух разных генетических фонах. Исследование целого ряда аспектов патогенеза ГКМП в кардиомиоцитах, полученных при направленной дифференцировке изогенных ИПСК, позволят выяснить статус исследуемых мутаций. В том случае если патогенность мутаций будет подтверждена, полученные данные позволят также провести сравнение молекулярных механизмов ГКМП, вызванной мутациями в генах саркомерных белков и генах сигнального пути RAS/MAPK.
Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта с помощью системы редактирования нуклеотидных последовательностей CRISPR/Cas9 будет создана панель изогенных линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) для проверки патогенности мутаций p.N515del в гене MYBPC3, p.M659I в гене MYH7, p.E329K и p.S1097T в гене SOS1 с неясным клиническим значением. В полученных при направленной дифференцировке изогенных линий ИПСК кардиомиоцитах будут изучены следующие аспекты, которые могут изменяться при гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП): размер клеток, динамика токов ионов кальция, внутриклеточная концентрация ионов кальция на стадии покоя кардиомиоцита, потенциал действия и биофизические характеристики различных ионных токов, сила сокращения и степень расслабления кардиомиоцитов, паттерн экспрессии регуляторных генов, генов саркомерных белков и генов, вовлеченных в регуляцию гомеостаза ионов кальция, и эффективность функционирования митохондрий. Сравнение кардиомиоцитов здорового донора, кардиомиоцитов здорового донора с внесенной мутацией, пациент-специфичных кардиомиоцитов и пациент-специфичных кардиомиоцитов с исправленной мутацией позволит установить, на какие аспекты патогенеза ГКМП оказывают влияние исследуемые мутации, что даст таким образом возможность проверить патогенность данных мутаций. Кроме того, на уровне клеточных моделей можно будет провести сравнение механизмов развития ГКМП, вызванной различными генетическими причинами: мутациями в генах саркомерных белков и мутациями в гене сигнального пути RAS/MAPK. Еще одним важным результатом данной работы станет получение пациент-специфичных линий ИПСК и кардиомиоцитов с мутациями p.E329K и p.S1097T в гене SOS1, поскольку для РАСопатий в настоящее время создано гораздо меньше клеточных моделей на основе ИПСК, чем для ГКМП, вызванной мутациями в генах саркомерных белков.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для выяснения патогенетического вклада вариантов p.N515del (c.1543_1545delAAC) в гене MYBPC3 и p.M659I (c.1977G>A) в гене MYH7 в развитие гипертрофической кардиомиопатии были подобраны направляющие РНК (или CRISPR РНК) и донорные олигонуклеотиды для внесения данных мутаций в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) здорового донора и их исправления в пациент-специфичных ИПСК. Редактирование 17-го экзона гена MYBPC3 и 18-го экзона MYH7 проводилось с помощью системы CRISPR/Cas9, компоненты которой доставлялись в ИПСК в виде рибонуклеопротеиновых комплексов посредством электропорации. В результате внесения мутаций p.N515del в ген MYBPC3 и p.M659I в ген MYH7 ИПСК здорового донора линии ICGi022-A были получены три линии ИПСК, гомозиготные по целевой делеции в гене MYBPC3, и одна линия ИПСК, гетерозиготная по целевой однонуклеотидной замене в гене MYH7. Проведены эксперименты по исправлению данных мутаций в пациент-специфичных линиях ИПСК ICGi029-A и ICGi019-B. Показано, что линии ИПСК после внесения гомозиготной делеции p.N515del в ген MYBPC3 сохраняли характерную для плюрипотентных стволовых клеток человека морфологию, нормальный кариотип и свои плюрипотентные свойства: экспрессировали маркеры плюрипотентного состояния, гены OCT4, NANOG, SOX2 и поверхностные антигены TRA-1-60 и SSEA4, и были способны давать производные трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы) при спонтанной дифференцировке в эмбриоидных тельцах. Также было обнаружено, что в гомозиготных по делеции p.N515del в гене MYBPC3 линиях ИПСК отсутствовала нецелевая активность системы CRISPR/Cas9 в 4 предсказанных сайтах.
Мононуклеарные клетки двух пациентов с РАСопатиями, являющихся носителями варианта с неясным клиническим значением p.E329K в гене SOS1 и патогенного варианта p.S259T в гене RAF1, были репрограммированы к плюрипотентному состоянию с помощью трансдукции вирусами Сендай, экспрессирующими гены плюрипотентного состояния OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC. Полученные в ходе репрограммирования линии ИПСК демонстрировали характерную для плюрипотентных клеток морфологию, экспрессировали свойственные плюрипотентным клеткам транскрипционные факторы (OCT4 и NANOG) и поверхностные антигены (TRA-1-60 и SSEA4), а также сохраняли пациент-специфичные мутации p.E329K в гене SOS1 и p.S259T в гене RAF1.
Публикации
1. Павлова С.В., Шаяхметова Л.Ш., Проняева К.А., Шульгина А.Е., Закиян С.М., Дементьева Е.В. Получение линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ICGi022- A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5 с внесенной в ген MYBPC3 с помощью системы CRISPR/Cas9 мутацией p.Asn515del Онтогенез (Russian Journal of Developmental Biology), - (год публикации - 2023)
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В результате внесения мутации p.M659I (c.1977G>A) в ген MYH7 индуцированных плюрипотентных клеток (ИПСК) здорового донора линии ICGi022-A с помощью системы CRISPR/Cas9 получена линия ИПСК, гетерозиготная по данной замене. Данная линия сохраняла свой плюрипотентный статус (экспрессировала маркеры плюрипотентного состояния и давала производные трех зародышевых листков при спонтанной дифференцировке), а также нормальный кариотип. Кроме того, в линии ИПСК с внесенной мутацией p.M659I в ген MYH7 не было обнаружено нецелевой активности системы CRISPR/Cas9.
Проведена направленная дифференцировка в кардиомиоциты линий ИПСК трех здоровых доноров (включая линию ICGi022-A, использованную для внесения мутаций), трех линий ИПСК, гомозиготных по внесенной мутации p.N515del (c.1543_1545delAAC) в ген MYBPC3, линии ИПСК, гетерозиготной по внесенной мутации p.M659I в ген MYH7, и пациент-специфичных линий ИПСК (ICGi029-А и ICGi019-B). Установлено, что кардиомиоциты, полученные при дифференцировке как пациент-специфичных линий ИПСК, так и линий ИПСК с внесенными мутациями, имели больший размер по сравнению с кардиомиоцитами, полученными при дифференцировке линий ИПСК здоровых доноров. С использованием технологии Seahorse между кардиомиоцитами, полученными при дифференцировке ИПСК с внесенной мутацией p.M659I в ген MYH7 и ИПСК здорового донора линии ICGi022-A, были выявлены различия в метаболизме. В кардиомиоцитах с внесенной мутацией p.M659I в ген MYH7 были снижены базовый уровень митохондриального дыхания (потребления кислорода, OCR) и базовый уровень гликолиза (внеклеточного закисления среды, ECAR).
С помощью редактирования пациент-специфичных ИПСК системой CRISPR/Cas9 получены линии ИПСК с исправленными мутациями p.M659I в гене MYH7 и p.N515del в гене MYBPC3. В линиях ИПСК с исправленной мутацией p.M659I в гене MYH7 подтверждена экспрессия маркеров плюрипотентного состояния.
Охарактеризованы ранее полученные линии ИПСК пациентов с РАСопатией, являющихся носителями вариантов p.E329K (c.985G>A) в гене SOS1 и p.S259T (c.775T>A) в гене RAF1. Показаны способность линий ИПСК дифференцироваться в производные трех зародышевых листков, сохранение нормального кариотипа и элиминация рекомбинантных вирусов Сендай, использованных для репрограммирования. Выполнен дизайн направляющих РНК и одцоцепочечных донорных олигонуклеотидов для внесения и исправления мутаций p.E329K и p.S259T в генах SOS1 и RAF1 в ИПСК. В пациент-специфичных линиях ИПСК (линии ICGi045-A и ICGi046-A) с использованием системы CRISPR/Cas9 выполнены эксперименты по исправлению данных мутаций.
Публикации
1. Дементьева Е.В., Зайцева А.К., Минина Ю.М., Мельник О.В., Закиян С.М., Костарева А.А. Получение линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ICGi045-A пациента с РАСопатией, являющегося носителем варианта p.Glu329Lys в гене SOS1 Онтогенез (Russian Journal of Developmental Biology), - (год публикации - 2024)
2. Дементьева Е.В., Клименко Е.С., Минина Ю.М., Закиян С.М., Костарева А.А. Получение линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ICGi046-A пациента с патогенным вариантом p.Ser259Thr в гене RAF1, ассоциированным с РАСопатией Онтогенез (Russian Journal of Developmental Biology), - (год публикации - 2024)
3. Проняева К.А., Павлова С.В., Закиян С.М., Дементьева Е.В. Роль генетического варианта p.Asn515del в гене MYBPC3 в формировании патологического фенотипа кардиомиоцитов in vitro Гены & Клетки, Материалы международного конгресса CRISPR-2023, сборник тезисов, С. 36 (год публикации - 2023)
4. Шульгина А.Е., Павлова С.В., Закиян С.М., Дементьева Е.В. Влияние генетического варианта c.1977G>A (p.M659I) в гене MYH7 с неясным клиническим значением на морфологию кардиальных производных индуцированных плюрипотентных клеток Гены & Клетки, Материалы международного конгресса CRISPR-2023, сборник тезисов, С. 50 (год публикации - 2023)
5. - Исследование новосибирских ученых поможет медикам эффективнее бороться с болезнями сердца ВЕСТИ Новосибирск, Россия1, - (год публикации - )
6. - Связь с заболеваниями сердца газета "Навигатор", Навигатор, № 30 от 4.08.2023 г., С. 27 (год публикации - )