Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Атрофия мышечных волокон, снижение экспрессии мРНК медленной изоформы тяжелых цепей миозина MyHCI (β) и повышение экспрессии быстрых изоформ MyHCIId/x и MyHCb часто наблюдается в камбаловидной мышце грызунов при функциональной разгрузке с применением модели вывешивания задних конечностей [Booth et al, 1990] и рассматриваются как последствия прекращения сократительной активности. Однако если разгрузку применяют дольше 3 суток, камбаловидную мышцу нельзя считать находящейся в со-стоянии полного покоя. В 1987 году Alford et al показали, что, начиная с 3 суток вывешивания крыс, значения интегральной ЭМГ оказываются повышенными и продолжают непрерывно повышаться вплоть до 14 суток воздействия. Этот феномен, который можно назвать «автономной» нервно-мышечной активностью, был воспроизведен в аналогичных условиях и другими авторами [Kawano et al, 2002, 2004; и другие]. Эта автономная активность вопреки ожиданиям не препятствует развитию атрофических событий и изменениям паттерна экспрессии мРНК медленной и быстрых изоформ MyHC. Природа этой активности до недавнего времени оставалась неизученной. В то же время, для другой модели мышечной инактивации, спинальной трансекции было показано, что вскоре после операции в некоторых мышцах, в том числе в камбаловидной мышце у грызунов регистрируется электрическая активность, которая быстро нарастает и впоследствии даже приводит к спастическому состоянию, характерному для большинства спинальных поражений у животных и человека. Эта активность оказалась результатом значительного снижения экспрессии калий-хлоридного ко-транспортера KCC-2 в нейронах поясничного отдела спинного мозга с после-дующим изменением направления хлоридного тока и инверсией мембранного потенциала. Эти изменения приводят к резкому повышению возбудимости мотонейронов, начинающих генерировать импульсы даже в ответ на действие тормозных медиаторов [Boulangez et al., 2010]. Снижение экспрессии KCC-2 может быть предотвращено введением нейролептика прохлорперазина. В нашей лаборатории недавно было показано достоверное снижение содержания KCC-2 в спинном мозге крыс,подвергнутых 7-суточной функциональной разгрузке [Kalashnikov et al., 2021]. У этих животных с помощью имплантированных электродов уже после 2 суток разгрузки была зарегистрирована автономная электрическая активность камбаловидной мышцы. С помощью администрации прохлоперазина удалось предотвратить снижение содержания KCC-2 в спинном мозге и значительно снизить автономную активность мышцы. Эти результаты дают нам возможность дальнейшего исследования внутримышечных и спинальных последствий снижения автономной активности мышцы в условиях разгрузки в рамках настоящего проекта. В отчетный период в рамках первой задачи проекта "Проследить динамику изменений содержания KCC-2 и сопутствующих сигнальных факторов спинного мозга на разных сроках функциональной разгрузки и сопоставить эти изменения с изменениями ЭМГ камбаловидной мышцы" и его четвертой задачи "Оценить роль отставленной тонической активности камбаловидной мышцы в перестройке ключевых молекулярных сигнальных процессов при развитии мышечной гипогравитационной атрофии" были проведены исследования влияния прохлорперазина, значительно снижающего уровень ЭМГ-активности камбаловидной мышцы при функциональной разгрузке, на пассивные и активные механические характеристики камбаловидной мышцы крысы, миозиновый фенотип мышечных волокон, а также маркеры сигнальных путей, контролирующих миозиновый фенотип, процесса синтеза и распада белка. Оценивали также изменения сигнальных маркеров поясничного отдела спинного мозга. Было проведено две основных серии исследований (3-х и 7- суточная разгрузка методом вывешивания задних конечностей животного) и одна дополнительная 7-суточная серия с определением содержания оксида азота (ЭПР спектроскопия). Как и предполагалось 3 и 7-суточное вывешивание привело к достоверному снижению сырого веса мышцы, что свидетельствует о развитии атрофических процессов. Однако отличий между группами с введением прохлорперазина и плацебо по этому параметру обнаружено не было. Не было обнаружено и отличий между группами вывешивания (с введением и без введения прохлорперазина) по пиковой изометрической силе камбаловидной мышцы. Напротив, при анализе пассивной жесткости изолированной камбаловидной мышцы оказалось, что если при вывешивании с плацебо этот показатель достоверно снижается после 3 и 7 суток воздействия, то применение прохлорперазина позволяет поддержать его значение на уровне, не отличимом от контрольного. Такой результат кажется парадоксальным и не находит объяснения. При анализе маркеров анаболических сигнальных путей после 3 суток воздействия значительных отличий между группами не было обнаружено (за исключением поддержания уровня фосфорилирования 4ЕBP на уровне контроля при использовании прохлорперазина). Однако после 7 суток воздействия снижение основных маркеров анаболических путей (включая параметры рибосомального биогенеза) было полностью или частично предотвращено введением прохлорперазина. Значительное снижение автономной активности камбаловидной мышцы на фоне функциональной разгрузки под действием прохлорперазина привело к закономерному углублению уже сниженной экспрессии регуляторов митохондриального биогенеза. Этот факт свидетельствует о том, что митохондриальный сигналлинг находится в прямой зависимости от мышечной активности. В то же время такое снижение автономной активности камбаловидной мышцы на фоне функциональной разгрузки под действием прохлорперазина обусловило поддержание контрольного уровня экспрессии мРНК изоформ тяжелых цепей миозина, сопровождающееся отсутствием экспорта NFATc1 из мышечных ядер. Этот феномен можно связать со снижением в этих условиях уровня фосфорилирования МАПК р38, которая может фосфорилировать NFAT и способствовать его экспорту из ядер [Sharlo et al., 2019]. При анализе сигнальных маркеров спинного мозга при воздействии прохлорперазином на фоне вывешивания было обнаружено достоверное увеличение содержания и экспрессии маркеров ГАМК-эргической системы. Предполагается, что в соответствии с планом работ на 2023 год, удастся найти объяснение ряду феноменов, обнаруженных при снижении автономной "тонической" активности постуральной мышцы при функциональной разгрузке

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Ранее проведенные исследования показали, что при использовании стандартного метода моделирования функциональной разгрузки (вывешивание задних конечностей грызунов) наблюдаемая спонтанная нервно-мышечная активность камбаловидной мышцы сопровождается снижением содержания калий-хлоридного ко-транспортера KCC2 в ткани поясничного отдела спинного мозга [Kalashnikov et al., 2021]. Такое снижение ведет к повышению возбудимости мотонейронов и к активации иннервируемых мышц [Boulenguez et al., 2010 и др.]. Мы предположили, что именно снижение содержания KCC2 является причиной развития спонтанной нервно-мышечной активности на фоне функциональной разгрузки. Для проверки этого предположения в рамках первого года проекта были проведены исследования с препаратом прохлорперазин, который известен своей способностью предотвращать снижение содержания KCC2 в мотонейронах после спинальной травмы (Liabeuf et al., 2017). Проведенные исследования и полученные результаты заставили нас усомниться в том, что наблюдаемые эффекты являются только следствием снижения спонтанной активности, а не прямого действия прохлорперазина на мышцу. Основной целью исследований в рамках проекта в 2023 году было изучение специфичности влияния спонтанной нервно-мышечной активности на сигнальные процессы в камбаловидной мышце в условиях функциональной разгрузки, а также проверка гипотезы о роли произвольной или вызванной мышечной активности в регуляции содержания KCC2 в спинном мозге. Для этого была предпринята экспериментальная серия с субдуральным введением прохлорперазина. Однако в ходе этого эксперимента были выявлены артефактные эффекты (резкое снижение веса животного, повышенная летальность животных и т. п.). Поэтому мы прибегли к другому способу проверки специфичности воздействия прохлорперазина. Было принято решение применить другой препарат, также препятствующий снижению KCC2 в спинном мозге CLP290 и сравнить его действие на мышцу с действием прохлорперазина. Оказалось, что CLP290, так же как прохлорперазин, приводит к снижению содержания KCC2 в поясничном отдела спинного мозга на фоне 7-суточной разгрузки задних конечностей. В течение 2-недельного антиортостатического вывешивания крыс оценивали влияние CLP290 на электрическую активность камбаловидной мышцы. Оказалось, что электрическая активность камбаловидных мышц при использовании CLP290 достоверно ниже, чем при вывешивании на фоне плацебо. Таким образом, можно с уверенностью утверждать, что спонтанная нервно-мышечная активность снижается при фармакологическом предотвращении снижения содержания KCC2 в поясничном отделе спинного мозга независимо от природы применяемого препарата. Это позволяет говорить о физиологической причинно-следственной зависимости между спонтанной мышечной активностью, возникающей на фоне разгрузки [Alford et al., 1987 и многие другие), и содержанием калий-хлоридного котранспортера в спинном мозге. Кроме того нами в отчетный период было проведено сравнение результатов введения CLP-290 и прохлорперазина (двух различных активаторов KCC2) на фоне 7 суток вывешивания для выявления побочных эффектов препаратов на сигнальные пути скелетной мышцы, не связанных с активацией KCC2. Оба препарата предотвращали снижение содержания KCC2 в спинном мозге животных, однако общими эффектами двух этих препаратов оказалось только супрессирующий эффект на ряд параметров биогенеза митохондрий, увеличение уровня фосфорилирования мишени AMPK - ацетил-коА-карбоксилазы, а также предотвращение снижения фосфорилирования анаболического маркёра 4E-BP1. Положительное влияние прохлорперазина на ряд катаболических параметров, уровень атрофии и фенотип волокон по всей видимости обусловлено его действием на содержание миоплазматического кальция через блокирование альфа-2 адренорецепторов, что является одним из известных побочных действий препарата. В отчетный период в соответствии с планом работ также проверялась гипотеза о роли произвольной или вызванной нервно-мышечной активности в поддержании нормального уровня содержания KCC2 в спинном мозге. Для проверки этой гипотезы в течение 7 суток проводили низкочастотную хроническую электростимуляцию мышц голени крысы на фоне функциональной разгрузки (вывешивания задних конечностей). В результате этого эксперимента было показано, что у стимулированных животных, в отличие от ложно оперированных вывешенных крыс, снижения уровня KCC2 в спинном мозге не наблюдалось. Выводы 1. Получены данные, подтверждающие наличие физиологической причинно-следственной зависимости спонтанной мышечной активности, возникающей на фоне разгрузки [Alford et al., 1987 и многие другие), с содержанием калий-хлоридного котранспортера в спинном мозге. 2. Подтверждено снижение уровня экспрессии параметров биогенеза митохондрий камбаловидной мышцы при снижении спонтанной мышечной активности. 3. Показано позитивное влияние локальной мышечной активности (низкочастотной хронической электростимуляции) на поддержание уровня KCC2 в спинном мозге.