Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Аутизм — широко распространенное нейроонтогенетическое заболевание. Основные симптомы аутизма – стереотипия и избегание социальных контактов, нарушения принятия решений, дают основание предположить участие дофаминергической (ДА) системы мозга. Имеющиеся данные подкрепляют это предположение. Фармакологическая активация D1 рецепторов дорзального стриатума или нокаут Д2 рецепторов вызывают аутистическое поведение, которое блокируется антагонистами Д1 рецепторов [8]. На экспериментальной модели аутизма – мышах линии BTBR T+Itpr3tf/J (BTBR), показано резкое понижение функциональной активности пре- и постсинаптических Д2 рецепторов [9] и чрезмерно высокая активность Д1 рецепторов стриатума [8]. Нарушение соотношения Д1/Д2 рецепторов свидетельствует о нарушении нейропластичности мозга. Одним из важнейших регуляторов процессов нейропластичности является нейротрофический фактор мозга (BDNF), поскольку он критически важен для нейро- и синаптогенеза, защиты и поддержания различных популяций нейронов, индукции долговременной потенциации. В значительной степени функции BDNF опосредуются через модуляцию различных нейротрансмиттерных систем, в их числе и ДА системы. Однако вклад BDNF в патогенез аутизма изучен плохо, а взаимодействие BDNF с ДА системой при аутизме не изучено вовсе. В настоящее время наиболее хорошо описанной и признанной экспериментальной моделью аутизма является инбредная линия BTBR. Несмотря на то, что ранее в нескольких работах было предпринята оценка экспрессии BDNF в мозге мышей BTBR [10-12], роль, которую играет BDNF в регуляции аутистически-подобного поведения, остаётся невыясненной. Открытым остается и важнейший вопрос – можно ли нормализовать (исправить) аутистическое поведение путём изменения экспрессии генов ключевых рецепторов или ферментов метаболизма нейротрансмиттеров, дисфункция которых привела к возникновению аутизма. В ходе работ в рамках первого этапа проекта было проведено три серии экспериментов. В первой серии мыши линии BTBR и контрольной линии C57Bl/6 подвергались ассоциативному обучению при помощи установки Phenomaster в модуле «оперантная стенка» (см. выше). После чего животные в структурах их мозга измеряли уровни мРНК и белка ключевых элементов BDNF и ДА систем мозга. В ознакомительный день нами не обнаружено статистически значимых различий в числе совершённых тычков, их длительности и числе полученных пеллет между животными двух исследованных линий. Однако с усложнением задачи мы наблюдали резкое снижение числа тычков, но не их длительности у мышей BTBR. На третий день эксперимента у мышей BTBR значительно сниженными были число тычков носом, их длительность и число полученных пеллет. Ассоциативное обучение вызвало повышение уровня мРНК Bdnf во фронтальной коре и стриатуме мышей C57Bl/6, но не у мышей BTBR. В среднем мозге у контрольных мышей BTBR уровень мРНК Bdnf был выше по сравнению с контролем C57Bl/6. У мышей BTBR, прошедших обучение, транскрипция Bdnf в среднем мозге существенно снизилась. Для экспрессии гена Ntrk2, кодирующего рецептор TrkB, выявлены схожие эффекты. Обучение вызвало повышение уровня мРНК гена Ntrk2 в стриатуме мышей C57Bl/6, а в среднем мозге привело к снижению экспрессии этого гена у мышей BTBR. Уровень мРНК гена Drd1 был выше у контрольных животных BTBR по сравнению с контролем C57Bl/6. В гиппокампе транскрипция гена Drd1 была снижена у опытных мышей C57Bl/6 по сравнению с контролем. Значимых изменений в стриатуме и среднем мозге не обнаружено. Во фронтальной коре у контрольных мышей BTBR уровень мРНК гена Drd2 был выше по сравнению с контролем C57Bl/6. В среднем мозге также выявлена межлинейная разница между контрольными животными и снижение уровня мРНК гена Drd2 в опытной группе BTBR по сравнению с контролем. Также обучение снизило мРНК гена Comt в среднем мозге мышей BTBR. Так как среди структур дофаминергической системы, стриатум играет важнейшую роль в процессе оперантного обучения, он был выбран для оценки уровня белка исследуемых генов. Не было выявлено эффекта тестирования на уровень белка зрелой формы BDNF. Однако у контрольных мышей BTBR были выше как уровень белка proBDNF, так и соотношение proBDNF/BDNF. Изменений в уровнях р75NTR рецептора, TrkB, фосфорилированной формы TrkB, их соотношения не выявлено. Также не выявлено межлинейной разницы и значимых эффектов обучения на уровни белка D1 и D2 рецепторов, фермента COMT и транспортёра DAT. Чтобы узнать могло ли одиночное содержание оказать эффект на транскрипцию Bdnf, мы сравнили уровни мРНК Bdnf у мышей BTBR, которые содержались либо в группе, либо по одиночке в течение четырёх дней. В гиппокампе уровень мРНК Bdnf не изменился, в то время как в коре у животных, подвергнутых одиночному содержанию транскрипция значительно выросла. В следующей серии экспериментов нами было исследовано влияние рекомбинантного белка BDNF на поведение и гены BDNF и ДА систем мозга мышей линии BTBR. Инъекция BDNF не оказала влияния на двигательную активность и исследовательское поведение животных, как и на тревожность. Обнаружено незначительное усиление стереотипного поведения у животных получивших центральную инъекцию BDNF. Не выявлено изменений в уровне мРНК гена Bdnf во всех исследованных структурах. Вместе с этим обнаружено увеличение транскрипции гена Ntrk2 в среднем мозге, однако, не выявлено изменений во фронтальной коре, гиппокампе и стриатуме. Ни в одной из исследованных структур не выявлено каких-либо изменений в уровне мРНК гена Ngfr. Не обнаружено изменений в транскрипции D1 и D2 рецепторов. Вместе с тем уровень мРНК фермента СОМТ был снижен во фронтальной коре и гиппокампе мышей опытной группы. Изменений транскрипции гена Comt в стриатуме и среднем мозге не обнаружено. Также в среднем мозге не выявлено эффекта центральной инъекции BDNF на уровни мРНК генов Th и Slc6a4, кодирующих фермент ТН и транспортёр дофамина соответственно. Не выявлено изменений в уровне белка proBDNF и зрелой формы BDNF во всех исследованных структурах. Однако соотношение proBDNF/ BDNF было снижено в стриатуме мышей, получивших инъекцию белка BDNF. Также было обнаружено снижение уровня белка TrkB рецептора во фронтальной коре и среднем мозге мышей опытной группы. В среднем мозге мышей, получивших центральную инъекцию BDNF, был снижен уровень фосфорилированной формы TrkB. Однако соотношение pTrkb/TrkB осталось без изменений. Эффектов центрального введения BDNF на уровни белка дофаминовых D1 и D2 рецепторов, белка фермента ТН в среднем мозге и транспортёра дофамина в стриатуме не выявлено. В третьей серии экспериментов нами было исследовано влияние сверхэкспрессии нейротрофического фактора BDNF в гиппокампе мышей линии BTBR на поведение и гены BDNF и ДА систем мозга. Уровень мРНК гена Bdnf был значительно увеличен в гиппокампе животных экспериментальной группы. Уровни белка BDNF и его предшественника proBDNF также были значительно повышены у животных получивших инъекцию AAV-BDNF. Нами выявлено значительное увеличение времени проведённого в центре арены в тесте «открытое поле» у животных со сверхэкспрессией BDNF. В тесте закапывания шариков сверэкспрессия BDNF привела к повышению количества шариков, закопанных меньше чем на половину, в то время как число шариков, закопанных больше чем на половину стало меньше. Полученные данные свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия BDNF приводит к снижению тревожности животных, усиливает исследовательское поведение и снижает выраженность стереотипного поведения. Индукция сверхэкспрессии BDNF в гиппокаме мышей BTBR привела к значительному повышению уровня мРНК гена Drd1. Изменений в уровнях мРНК генов Ntrk2, Ngfr и Drd2 выявлено не было. Одновременно с этим, сверхэкспрессия BDNF не оказала влияния на уровни белка TrkB, p75NTR, D1 и D2 рецепторов.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Аутизм — широко распространенное нейроонтогенетическое заболевание. Основные симптомы аутизма – стереотипия и избегание социальных контактов, нарушения принятия решений, дают основание предположить участие дофаминергической (ДА) системы мозга. Имеющиеся данные подкрепляют это предположение. Фармакологическая активация D1 рецепторов (DRD1) дорзального стриатума или нокаут D2 рецепторов (DRD2) вызывают аутистическое поведение, которое блокируется антагонистами DRD1. На экспериментальной модели аутизма – мышах линии BTBR T+Itpr3tf/J (BTBR), показано резкое понижение функциональной активности пре- и постсинаптических DRD2 и чрезмерно высокая активность DRD1стриатума, что свидетельствует о нарушении нейропластичности мозга. Одним из важнейших регуляторов процессов нейропластичности является нейротрофический фактор мозга (BDNF), поскольку он критически важен для нейро- и синаптогенеза, защиты и поддержания различных популяций нейронов, индукции долговременной потенциации. В значительной степени функции BDNF опосредуются через модуляцию различных нейротрансмиттерных систем, в их числе и ДА системы. Однако вклад BDNF в патогенез аутизма изучен плохо, а взаимодействие BDNF с ДА системой при аутизме не изучено вовсе. Также открытым остается и важнейший вопрос – можно ли нормализовать (исправить) аутистическое поведение путём изменения экспрессии генов ключевых рецепторов или ферментов метаболизма нейротрансмиттеров, дисфункция которых привела к возникновению аутизма. В ходе работ второго этапа выполнения проекта был проанализирован уровень белка ключевых генов BDNF и ДА систем в стриатуме, гиппокампе, среднем мозге и фронтальной коре мышей линии BTBR (модель аутизма) и C57Bl/6J («нормальные» животные), проходивших обучение в парадигме «оперантная стенка», заключающейся в обучении животного определенной последовательности тычков носом для получения сладкой пеллеты в качестве положительного подкрепления. Было обнаружено существенное межлинейное различие по уровню белка-предшественника proBDNF: во фронтальной коре и стриатуме мышей линии BTBR уровень proBDNF был значительно выше, чем у мышей линии C57Bl/6J. Также эффект линии выявлен для соотношения proBDNF/BDNF во фронтальной коре. У контрольных и опытных мышей BTBR данное соотношение было выше. Эффект линии для соотношения proBDNF/BDNF выявлен и в стриатуме. Соотношение было выше как у контрольной группы BTBR, так и у опытной. При анализе соотношения pTrkB/TrkB, которое показывает степень активации рецептора, в стриатуме выявлено взаимодействие факторов, однако апостериорное сравнение выявило лишь снижение соотношения между контрольными группами C57Bl/6J и BTBR. Каких-либо изменений в уровне белка рецептора p75NTR не выявлено. При анализе уровня белка D2 рецептора в среднем мозге, выявлен эффект линии. У контрольных мышей BTBR уровень белка рецептора был достоверно выше по сравнению с контролем C57Bl/6J. Вместе с тем не выявлено различий в уровне белка DRD1, ферментов COMT и TH, а также транспортёра DAT. Субхроническое введение агониста DRD2 суманирола оказало неожиданный эффект на когнитивные способности мышей BTBR в тесте «оперантная стенка». В ознакомительный день нами не обнаружено статистически значимых различий в числе совершённых тычков, их длительности и числе полученных пеллет между животными контрольной и опытной групп. С усложнением задачи мы наблюдали сравнимые способности к обучению у контрольных и опытных животных. Однако на третий день эксперимента у мышей, получавших суманирол, достоверно сниженными было число полученных пеллет. При этом препарат не оказывал влияния ни на общий пройденный путь за всё время эксперимента, ни на потребление пищи и воды. Субхроническое ведение препарата привело к повышению уровня дофамина и его метаболитов - дигидроксенифенилуксусной (ДОФУК) и гомованилиновой (ГВК) кислот в среднем мозге мышей линии BTBR. Вместе с этим, изменений в индексе катаболизма ДОФУК/ДА, ГВК/ДА и ГВК/ДОФУК не обнаружено. Иная картина выявлена нами в стриатуме. Здесь уровень дофамина в экспериментальной группе снижен. Также снижен на уровне тенденции уровень ГВК. Вместе с тем, повышено соотношение ДОФУК/ДА и ГВК/ДА. При условии, что уровень ДОФУК оставался неизменен, данные результаты могут свидетельствовать не об увеличении катаболизма, а скорее о снижении поступления дофамина в стриатум. Препарат не оказал влияния на уровень мРНК генов Bdnf и Ntrk2 ни в одной из исследованных структур. Вместе с тем обнаружено достоверное увеличение уровня мРНК гена Ngfr в среднем мозге мышей опытной группы. Также были повышены уровни мРНК гена Drd1, Drd2, Comt и Slc6a3. Уровень мРНК гена Th был повышен на уровне тенденции. Кроме того, отмечено повышение уровня мРНК гена Drd2 во фронтальной коре мышей опытной группы. Не выявлено эффекта ведения суманирола на уровень зрелого белка BDNF, его проформы и их соотношения ни в стриатуме, ни в среднем мозге. Препарат не повлиял на уровень белка TrkB рецептора, его фосфорилированной формы и их соотношения, а также на уровень белка рецептора р75NTR. Нами выявлена лишь тенденция к увеличению уровня белка DRD1 рецептора в среднем мозге мышей, получавших суманирол, что согласуется с данными по уровню мРНК. Однако эффекта на уровень белка DRD2, СОМТ, ТН и DAT не выявлено в исследованных структурах. Хроническое (14 дней) введение суманирола не повлияло на тревожность животных, однако несколько снизило исследовательскую активность. Также хроническая активация DRD2 рецепторов не оказала влияния на распознавание объектов, стереотипное поведение и на индекс социального предпочтения, и время исследования социального объекта в «трёхкамерном социальном тесте». При этом введение препарата привело к увеличению индекса ДОФУК/ДА и снижению ГВК/ДОФУК в среднем мозге, что свидетельствует об усилении катаболизма дофамина. В стриатуме, напротив, в экспериментальной группе повышен уровень дофамина, ДОФУК и ГВК, но не изменены индексы катаболизма, что свидетельствует о пропорциональном усилении обмена дофамина в данной структуре. Также на второй год работ в рамках проекта было исследовано влияние AAV-опосредованной сверэкспрессии нейротрофического фактора мозга BDNF во фронтальной коре мышей BTBR на поведение и ключевые элементы BDNF и дофаминовой системы. Было подтверждено, что введение конструкта приводит к увеличению экспрессии BDNF как на уровне мРНК, так и на уровне белка. При этом уровень proBDNF не изменился. Сверхэкспрессия BDNF не оказала влияния на двигательную активность и исследовательское поведение животных и их тревожность. Также не обнаружено эффектов повышения экспрессии BDNF во фронтальной коре на стереотипное поведение. Вместе с тем, в «трёхкамерном социальном тесте» выявлено не только достоверное увеличение индекса социального предпочтения, но и в целом более длительное исследование социального объекта у животных со сверхэкспрессией BDNF во фронтальной коре. При этом, индукция сверхэкспрессии BDNF во фронтальной коре мышей BTBR привела к значительному повышению уровня мРНК генов Ngfr и Drd2. Изменений в уровнях мРНК генов Ntrk2 и Drd1 выявлено не было. Одновременно с этим, сверхэкспрессия BDNF не оказала влияния на уровни белка TrkB, p75NTR, DRD1 и DRD2 рецепторов. На второй год работ в рамках проекта нами также был создан и успешно верифицирован AAV-конструкт, позволяющий индуцировать сверхэкспрессию DRD2 рецепторов в нейрональных клетках. Полученный конструкт был введён в дорсальный гиппокамп мышей линии C57Bl/6J. Через 4 недели после введения конструкта было показано, что созданный конструкт позволяет успешно усиливать экспрессию D2 рецептора в мозге мыши.