Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее частой причиной деменции во всем мире, оказывая все большее влияние на стареющее общество. Следует отметить, что процент людей с БА резко увеличивается с возрастом: 3% людей в возрасте 65-74 лет, 17% людей в возрасте 75-84 лет и 32% людей в возрасте 85 лет и старше страдают БА [6]. С другой стороны, увеличение продолжительности жизни объявлено одним из приоритетных направлений внутренней политики России. В соответствии с указом о целях национального развития России, подписанным президентом Владимиром Владимировичем Путиным 21 июля 2020 года, ожидаемая продолжительность жизни в России должна быть увеличена до 78 лет к 2030 году. Таким образом, разработка эффективных терапевтических стратегий против БА и связанных с БА расстройств является одной из чрезвычайно актуальных проблем современной нейробиологии и фундаментальной медицины. БА характеризуется двумя основными гистопатологическими признаками: (1) внеклеточными амилоидными бляшками, образованными нерастворимыми агрегатами гидрофобного бета-амилоидного пептида, и (2) внутриклеточными нейрофибриллярными клубками, состоящих из гиперфосфорилированного Tau-белка, ассоциированного с микротрубочками. Накопление этих двух основных типов агрегатов приводит к необратимой нейродегенерации, которая медленно распространяется по всему мозгу и вызывает прогрессирующую потерю памяти, снижение когнитивных функций, тяжелую деменцию и, наконец, смерть. Хотя многие поколения исследователей пытались понять механизмы, лежащие в основе этого заболевания, молекулярные и клеточные процессы, приводящие к его возникновению и прогрессированию, все еще далеки от полного понимания. Соответственно, до сих пор доступно только симптоматическое лечение, а коррекция причин заболевания на настоящий момент не возможна. В течение последнего десятилетия серотонинергическая система привлекла пристальное внимание как перспективная мишень для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности БА. Однако роль отдельных рецепторов серотонина в нейродегенеративных расстройствах остается неясной. В этом отношении использование серотониновых рецепторов в качестве мишени для лечения БА представляет собой новую и очень многообещающую терапевтическую стратегию. В ходе работ в рамках первого этапа проекта была исследована связь между 5-HT4-опосредованной передачей сигналов и фосфорилированием Tau-белка. Для этого клетки нейробластомы N2A трансфецировали векторами, несущими последовательности меченого гемагглютинином (HA)-5-HT4 рецептора и меченого зеленым флуоресцентным белком мутантного Tau[R406W]-eGFP человека. Этот мутант связан с унаследованными формами фронтотемпоральной деменции (FTDP-17) и облегчает агрегацию Tau-белка. Фосфорилирование Tau-белка определяли с помощью фосфоспецифического (Thr181) антитела АТ270. Этот выбор подтверждается недавними исследованиями, в которых Tau-белок, фосфорилированный по треонину 181, был успешно оценен как неинвазивный диагностический и прогностический биомаркер для скрининга Tau патологии, связанной с болезнью Альцгеймера и FTLD (Frontotemporal lobar degeneration). Было показано, что ко-экспрессия 5-HT4 рецептора с Tau[R406W] приводила к выраженному гиперфосфорилированию Tau-белка, которое сопровождалось увеличением общего количества Tau-белка. Интересно, что фосфорилирование Thr181 снижалось как при стимуляции рецептора высокоселективным агонистом BIMU-8, так и при воздействии обратного агониста GR-113808, а также при блокировании 5-HT4 рецептора антагонистом GR-125487. Однако, применение данных препаратов не предотвращало индуцированное рецептором накопление Tau-белка. Активация 5-НТ4 рецептора высокоселективным агонистом и обратным агонистом привела к увеличению фосфорилирования ERK1/2 киназы, без изменений в уровне общего белка ERK1/2. Принимая во внимание, что фосфорилирование киназ существенно влияет на их активность, полученные в работе данные позволяют предположить, что данная киназа играет важную роль в реализации эффектов 5-НТ4 рецептора на фосфорилирование Tau-белка. Полученные нами результаты были воспроизведены нашими коллегами из Института клеточной физиологии (Высшая Медицинская Школа Ганновера, Ганновер, Германия). Было показано, что ко-трансфекция 5-HT4 рецептора с Tau[R406W] приводит к значительному усилению гиперфосфорилирования и накопления Tau-белка в культуре клеток. При этом добавление в культуру клеток обратного агониста 5-НТ4 рецептора SB207266 вызывает снижение гиперфосфорилирования и накопления Tau-белка до базового уровня. Интересно отметить, что в наших экспериментах не было обнаружено влияния обратного агониста 5-HT4 рецептора, GR-113808, на накопление Tau-белка, что указывает различия в эффектах использованных фармакологических препаратов. Также работами наших немецких коллег с использованием подхода BiFC было показано, что 5-HT4 рецептор способствует агрегации Tau-белка в клетках HEK-Tau-BiFC. Таким образом было обнаружено, что именно 5-HT4 рецептор способствует агрегации Tau-белка и, как следствие, дегенерации клеток. В качестве контрольного рецептора в данном эксперименте использовался один из самых широко исследуемых серотониновых рецепторов - 5-НТ1А рецептор. Оказалось, что этот рецептор никак не влияет на агрегацию Tau-белка, хотя, тем не менее, приводит к гибели клеток. При помощи саркозилового фракционирования также подтверждено, что совместная экспрессия Tau-белка с 5-HT4 рецептором приводит к усиленному образованию агрегатов Tau-белка. Обратный агонист 5-HT4 рецепторов, GR125487, ослабляет этот эффект серотониновых рецепторов, тогда как агонист BIMU8, напротив, усиливает. Полученные в предыдущих экспериментах результаты были подтверждены и в эксперименте с использованием BiFC подхода. Показано, что добавление обратного агониста GR125487 к клеткам HEK293 Tau-BiFC, трансфицированных pcDNA или (HA) 5-HT4 рецептором оказывает существенное влияние на агрегацию Tau-белка. Таким образом с использованием различных подходов показано, что базовой активности 5-HT4 рецепторов достаточно для усиления агрегации Tau-белка. В качестве задела на следующий этап работы нами был создан и верифицирован AAV конструкт, несущий плазмиду, кодирующую малую образующую шпильку РНК (shRNA), для подавления экспрессии 5-НТ4 рецептора in vivo. Показано, что через месяц после введения аденоассоциированного вирусного конструкта, несущего shRNA#1, во фронтальную кору мышей линии C57Bl/6J происходит существенное подавление экспрессии гена 5-НТ4 рецептора. Данный конструкт и был выбран для последующих исследований.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее частой причиной деменции во всем мире, оказывая все большее влияние на стареющее общество. Следует отметить, что процент людей с БА резко увеличивается с возрастом: 3% людей в возрасте 65-74 лет, 17% людей в возрасте 75-84 лет и 32% людей в возрасте 85 лет и старше страдают БА (2020). Таким образом, разработка эффективных терапевтических стратегий против БА является одной из чрезвычайно актуальных проблем современной нейробиологии и фундаментальной медицины. В течение последнего десятилетия серотонинергическая система привлекла пристальное внимание как перспективная мишень для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности БА. Однако роль отдельных рецепторов серотонина в нейродегенеративных расстройствах остается неясной. В этом отношении использование серотониновых рецепторов в качестве мишени для лечения БА представляет собой новую и очень многообещающую терапевтическую стратегию. В ходе работ в рамках второго этапа проекта было исследовано влияние подавления экспрессии 5-НТ4 рецептора во фронтальной коре мышей стандартной линии C57Bl/6J при помощи аденоассоциированного генетического конструкта на различные виды поведения. Было обнаружено, что подавление экспрессии гена 5-НТ4 рецептора во фронтальной коре мышей C57Bl/6J, подтверждённое при помощи количественной ОТ-ПЦР в реальном времени, не оказывало существенного влияния на двигательную и исследовательскую активность в тесте «открытое поле», на кратковременную память, оцененную при помощи «recency test», долговременную память и обучение, исследованные с помощью теста распознавания нового объекта (Novel object recognition), депрессивно-подобное поведение в тесте «подвешивание за хвост». При этом нокдаун 5-НТ4 рецептора в коре мышей C57Bl/6J привел к существенному усилению тревожности, оцененной в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Также в ходе второго года выполнения проекта нами была проведена оценка паттернов экспрессии ключевых серотониновых рецепторов, а также нейротрофического фактора мозга BDNF и его рецепторов в структурах мозга крыс линии OXYS, являющихся моделью спорадической формы БА, по сравнению с контрольными крысами линии Wistar, в разном возрасте. Так во фронтальной коре у крыс OXYS нами выявлен значимо больший уровень мРНК гена Bdnf в возрасте 20 дней. Интересно, что в возрасте 3.5 месяца различий в уровне мРНК Bdnf между крысами OXYS и Wistar не выявлено, однако у 18-месячных крыс OXYS наблюдается выраженное снижение транскрипции Bdnf. Также во фронтальной коре между крысами OXYS и Wistar нами не было обнаружено различий в уровне белка BDNF, его рецептора TrkB и фосфорилированной формы pTrkB. При этом интересно, что соотношение pTrkB/TrkB у крыс OXYS было достоверно снижено в возрасте 20, что указывает на сниженную функциональную активность TrkB рецептора. Выявлено повышение уровня мРНК генов Htr2a и Htr7 у крыс OXYS возрасте 20 дней. При этом в возрасте 18 месяцев у крыс OXYS наблюдается достоверное снижение транскрипции гена Htr2a. Для уровня белка 5-HT1A рецептора у крыс OXYS выявлена сильная тенденция к росту в возрасте 20 дней. В гиппокампе обнаружено, что у крыс OXYS в возрасте 20 дней уровень мРНК гена Bdnf был существенно выше, чем у крыс Wistar, а в возрасте 18 месяцев наблюдается лишь слабая тенденция к снижению. Также слабая тенденция к повышению уровня мРНК гена Ntrk2 выявлена у крыс OXYS в возрасте 20 дней. Выявлено повышение уровня мРНК гена Htr1a в 20 дней и 3.5 месяца в гиппокампе крыс OXYS. Сходный паттерн экспрессии был выявлен для генов Htr4 и Htr2a. Вместе с тем, изменения в уровне мРНК не сопровождались соответствующими изменениями в уровне белка. Также было проведено исследование эффектов обратного агониста 5-НТ7 серотониновых рецепторов, амисульприда (3 недели, 3 мг/кг, внутрибрюшинно), на фосфорилирование Tau белка и поведение крыс OXYS в трех возрастах (1, 3 и 6 месяцев). Мы обнаружили, что хроническое применение амисульприда приводило к резкому снижению фосфорилирования Tau во фронтальной коре и гиппокампе трехмесячных крыс OXYS. Также в гиппокампе 1- и 3-месячных крыс амисульприд снижал уровень мРНК гена Cdk5, кодирующего одну из основных Tau киназ, участвующих в индуцированном рецептором 5-НТ7 эффекте на фосфорилирование Tau белка. На основании результатов нашей работы мы предполагаем, что амисульприд обладает терапевтическим потенциалом для лечения БА и наиболее эффективен на ранних стадиях заболевания. Мы разработали дизайн и провели клонирование генетических конструкций для создания трансгенных животных, экспрессирующих патогенные варианты белков человека APP и Tau. Идея дизайна состоит в том, что сильный конститутивный промотор CAG обеспечивает экспрессию длиной бицистронной мРНК. C начала этой РНК транслируется патогенный вариант белка человека (Tau R406W или APP Swed/Ind). Второй белок, репортерный (ZsGreen или mCherry) транслируется с IRES (Internal Ribosome Entry Site — участок внутренней посадки рибосомы). Однако, вставленный между сайтом начала транскрипции (TSS) и кодирующей частью конструкции сигнал полиаденилирования SV40 терминирует транскрипцию поэтому бицистронная РНК не синтезируется. Сигнал полиаденилирования (STOP-кассета) конвергентно направленными LoxP сайтами. Поэтому CRE-рекомбиназа может вырезать STOP-кассету и запустить продуктивную транскрипцию. Таким образом, интегрировавшиеся в геном мышей конструкции не приводят к негативным последствиям для здоровья животных, так как с кодирующие части не экспрессируются. Однако, если таким трансгенным животным с помощью стереотаксического инъекции ввести аденоассоциированные вирусы, обеспечивающие экспрессию CRE-рекомбиназы в нейронах, то CRE-рекомбиназа вырежет STOP-кассету и запустит экспрессию патогенных вариантов белков человека в нейронах мышей. Пока нам не удалось получить животных с интеграцией в геном введенных конструкций, даже несмотря на то, что объем эксперимента был увеличен в 3-4 раза от запланированных 100 инъекций на конструкцию. При этом, мы не наблюдали избыточной смертности эмбрионов после инъекции и их развития до стадии бластоцисты. Все выжившие бластоцисты были позитивны по наличию конструкции в геноме. Так что, по-видимому, животные носители введенных конструкций в геном погибают на более поздних стадиях. Работа по созданию трансгенных животных – модели индуциуемых Tau- и амилоидопатий будет продолжена в следующем году. Было показано, что ко-трансфекция мутантного Tau белка eGFP-tau[R406W], склонного к образованию нейрофибрилярных клубков (НФК), и серотонинового 5-НТ4 рецептора приводит к значительному усилению образования агрегатов Tau белка в клетках нейробластомы. При этом стимуляция рецептора агонистом 5-СТ не привела к значительным изменениям интенсивности образования НФК, что позволило сделать вывод о том, что именно базальная активность 5-НТ4 рецептора играет ключевую роль в стимуляции гиперфосфорилирования и агрегации Tau белка при БА. Немного неожиданно, но ингибирование базальной активности 5-НТ4 рецептора обратным агонистом GR-125487 не оказало выраженного влияния на интенсивности образования НФК. Также обнаружено, что ко-трансфекция мутантного Tau белка eGFP-tau[R406W], склонного к образованию нейрофибрилярных клубков, и серотонинового 5-НТ4 рецептора приводит к усилению образования как растворимых, так и нерастворимых агрегатов Tau белка в клетках нейробластомы. При этом ингибирование базальной активности 5-НТ4 рецептора его обратным агонистом GR-125487 снижало количество как растворимых, так и нерастворимых агрегатов Tau белка. Далее был выполнен анализ на первичной культуре нейронов префронтальной коры головного мозга мышей. Показано, что ингибирование базальной активности 5-НТ4 рецептора его обратным агонистом GR-125487, снижало количество НФК Tau белка в первичной культуре нейронов, трансфецированных eGFP-tau[R406W], склонным к агрегации. Таким образом, было доказано, что базальная активность 5-НТ4 рецептора играет ключевую роль в стимуляции гиперфосфорилирования и агрегации Tau белка при БА.