Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За отчетный период, в рамках проекта в соответствие с планами было проведено как структурно-генетическое, так и иммунологическое исследование пяти штаммов, выделенных в различных городах России и Германии: Смоленск (штамм K127, K98, К218), Иркутск (штамм К135, изолят RES-546), К89 (Саарленд, Германия). Таким образом, количество объектов исследования полностью соответствовало и даже превышало план работы (см. пункт 1.1. «Заявленный в проекте план работы научного исследования на отчетный период»). Молекулярное типирование этих штаммов показало, что некоторые из них относятся к К-типам, которых ранее не были исследованы в отношении строения и биосинтеза КПС, Эти данные подтверждают независимую диверсификация К-полисахаридов ацинетобактера в различных географических регионах. Штаммы культивировали, биомассу экстрагировали водным фенолом и полученные КПС очищали гель-хроматографией. Состав КПС определяли с помощью ГЖХ-хроматографии ацетатов полиолов, полученных дериватизацией моносахариднов, высвобожденных полным кислотным гидролиза КПС. Строение КПС устанавливали методами одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н и 13С и подтверждали методами избирательного расщепления, такими как а) распад по Смиту, включающий избирательное периодатное окисление и мягкий кислотный гидролиз связей окисленных моносахаридов, б) избирательный сольволиз трифторуксусной кислотой. Основными компонентами исследованных КПС оказались такие широко распространенные в бактериальных углеводах моносахариды, как D-глюкоза, D-галактоза, N-ацетил-D-глюкозамин (D-GlсNAс и N-ацетил-D-галактозамин (D-GalNAc). Также в некоторых КПС были обнаружены необычные, либо уникальные компоненты. Объекты исследования. Описание проделанной работы и результаты: 1) Acinetobacter baumannii K89 (изолят LUH5552). КПС исследован спектроскопией ЯМР, методами компонентного анализа, а также с помощью селективного расщепления по Смиту. Капсульный полисахарид содержал в К-звене D-Fucp3NAc, редко встречающийся компонент. Боковая цепь состояла из звеньев состава β-D-Glcp-(1→2)-β-D-Fucp3NAc-(1→6)-D-Glcp, присоединенного по положению 4 к D-GalpNAc к моносазариду в главной цепи двухкомпонентного К-звена →3)-α-D-GalpNAc-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→ 2) Acinetobacter baumannii K98 (изолят REV-1184), ). Структура капсулярного полисахарида K98 была установлена методами сахарного анализа, ЯМР-спектроскопии и масс спектрометрии ESI-MS. В составе, кроме обычных моносазхаридов, были обнаружены 2-ацетамидо-2-дезокси-D-галактуроновая кислота (D-GalpNAcA), и хиновозамин (D-QuipNAc), а остаток GalpNAc являлся ацеталированным производным с (R)-4,6-пировиноградной кислоты. 3) Acinetobacter baumannii K218 (изолят 52-249). Данный КПС отличался наличием в составе разветвленного тетрасахаридного повторяющегося звена высшего девятиуглеродного сахара - псевдаминовой кислоты ( 5,7-диацетамидо-3,5,7,9-тетрадезокси-L-глицеро-L-манно-нон-2-улозоновой кислоты, Pse5Ac7Ac) в боковой цепи. Оперон psaABCIJF, включающий шесть генов, был идентифицирован в составе генного кластера штамма K218. Интересно, что КПС K218, как выяснилось, обладал близким структурным сходством с ранее исследованным штаммом Acinetobacter baumannii К46, а разница заключалась в том, что у К46 остаток Pse5Ac7Ac был О-ацетилированным по положению 4. Это позволило точно аннотировать гены гликозил трансфераз, переносящих остаток Pse в этих двух штаммах – у штамма К218 это оказался фермент KpsS3, ответственный за образование связи Pse-(2-6)-D-Galp, ген которого был депонирован в базу данных GenBank. Сама по себе зада идентификации гликозил трансфераз практически невозможна без сравнения структур родственных полисахаридов и их генных кластеров биосинтеза. 4) Acinetobacter baumannii K135 (изолят RES-546). Структуры КПС A. baumannii и соответствующие генные кластеры биосинтеза КПС отличаются значительным разнообразием, и в то же время многие из них являются родственными друг другу. Особенностью КПС многих типов A. baumannii является присутствие в их составе изомеров 5,7 диамино-3,5,7,9-тетрадезоксинон-2-улозоновой кислоты. Три из них – ацинетаминовая кислота (L глицеро-L-альтро-изомер), 8-эпиацинетаминовая кислота (D глицеро-L-альтро-изомер) и 8 эпипсевдаминовая кислота (D-глицеро-L-манно-изомер) – в других природных углеводах до настоящего времени не обнаружены. Конкретно 8-эпимер псевдаминовой кислоты (8ePse5Ac7Aс), образующийся из Pse5Ac7A через промежуточное 8-кетопроизводное, встречается значительно реже; он присутствует в КПС типов K58 (штамм BAL-062) и K135 (штамм Res546, ранее также относившийся к типу K58). Данное уникальное производное (8ePse5Ac7Aс) было идентифицировано и описано в трех наших статьях в 2022 году в ходе установления структуры КПС 135. Выяснилось, что, как и в случае вышеприведенного штамма K218, генный кластер имеет такой же оперон, состоящий из шести генов и отвечающий за синтез Pse5Ac7Ac. Но ген, отвечающий за конверсию Pse5Ac7Ac в 8ePse5Ac7Ac в кластере не был обнаружен (вероятно, он находится в хромосоме вне кластера). Таким образом, требуется провести дополнительные исследования для выявления пути биосинтеза 8-эпи-псевдаминовой кислоты. 5) Последовательности генов в геномных кластерах биосинтеза КПС A. baumannii между консервативными генами fkpA и lldP, фланкирующими К-локус, были получны путем сборки коротких ридов в контиги, используя программу SPAdes. Cиквенсы всех кластеров депонировали в базе данных GenBanК, и входящие в кластеры гены аннотировали сравнением с последовательностями в доступных базах данных (аннотации генных кластеров доступны также файлах приложенных к отчету статьях в формате PDF. В целом, генетические данные полностью согласуются с установленными нами структурами КПС. В совокупности структурно-генетические данные вносят существенный вклад в разработку молекулярной основы для классификации штаммов ацинетобактера по К-антигенам и прояснению путей их эволюции. 6) Для получения новых иммунопрепаратов на основе белковых конъюгатов олигосахаридных фрагментов КПС как прототипов вакцин против инфекций, вызываемых ацинетобактером, подобраны бактериофаги, специфически расщепляющие КПС (эти работы были описаны в предыдущем отчете). Непосредственно на этапе 2022 года мы закончили исследование другого типа гликоконьюгатной вакцины, полученной методом селективного перийодатного расщепления КПС A. baumannii K9 с последующей конъюгацией полученных олигосахаридных фрагментов разной длины (разделенных гель-хроматографией) с набором инертных белков-носителей (бычий сывороточный альбумин - БСА, овальбумин, гемоцианин). Было выяснено, что наибольшей эффективностью обладает гликонъюгатная вакцина на основе БСА с димерами К-звеньев. Анализ полученных данных показывает, что практически все используемые для иммунизации конъюгаты фрагментов КПС типа К9 с белками-носителями вызывают длительный иммунный ответ. Так, титр антител, как суммарных, так и иммуноглобулинов класса М, против КПС типа 9 сохранялся в сыворотке экспериментальных мышей достаточно стабильным в течение 10 месяцев после последней иммунизации. При этом также стабильным сохранялся и титр опсонизации исследуемых сывороток. Полученные данные по исчерпывающим биологическим испытаниям на животных были опубликованы в высокорейтинговом журнале Microbiology Spectrum. Все полученные на этапе 2022 года данные были представлены нами в восьми статьях с упоминанием о поддержке Фонда РНФ, из которых в отчете (см пункт 1.7) представлены шесть. С учетом того, что 5 статей принадлежат к первому квартилю (Q1), то коллектив уже на первом году превысил заявленные требования к публикационным показателям. Таким образом, план работы на 2022 году был полностью выполнен.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Конкретные научные результаты в соответствие с планом проводились по трем главным направлениям: 1) Структурное исследование капсулярных полисахаридов (КПС) Acinetobacter baumannii 2) Генетическое исследование локусов биосинтеза КПС ацинетобактера (KL-локусы) 3) Исследование расщепления (КПС) ацинетобактера деполимеразами (гликозидазами) хвостовых шипов специфических бактериофагов. Всего в работе на этапе 2023-го года было изучено 3 новых штамма ацинетобактера (K70, K3-v1 и K135) с ранее неизвестными структурами КПС. Еще были использованы более 10-ти штаммов, ранее изученных нами и другими исследователями, выделенных в различных городах России, Китая, Чехии, Италии и США. Для штаммов ацинетобактера были подобраны бактериофаги, были выделены рекомбинантные белки-деполимеразы хвостовых шипов с гликозидазной активностью для изучения специфики расщепления КПС ацинетобактеров. Это направление исследований открывает возможность получения гликонъюгатных вакцин против антибиотико-резистентных штаммов A. baumannii. Молекулярное типирование штаммов показало, что некоторые из них относятся к К-типам, которых ранее не были исследованы в отношении строения и биосинтеза КПС. Генетические данные полностью согласуются с установленными структурами КПС. В совокупности структурно-генетические данные вносят существенный вклад в разработку молекулярной основы для классификации штаммов ацинетобактера по К-антигенам и прояснению путей их эволюции. Штаммы A. baumannii K70 (изолят SGH0807, Сингапур) и A. baumannii K3-v1 (изолят AB5001, Смоленск) были впервые охарактеризованы в структурно-генетическом плане и показано их близкое генетическое родство с другими штаммами ацинетобактера (K9 и K3, соответственно) при различии в структурах КПС. Основными компонентами исследованных КПС оказались широко распространенные в бактериальных углеводах моносахариды. Но также в некоторых КПС были обнаружены необычные, либо уникальные компоненты, такие как 2-N-ацетил-галактуроновая кислота (GalpNAcA) в КПС К70, 2,3-N-диацетил-4-O-ацетат-глюкуроновая кислота (GlсpNAc3NAc4OAcA) в КПС К3 и 8-эпимер псевдаминовой кислоты (8ePse5Ac7Aс) - последний в составе КПС был обнаружен впервые в природе. Объекты исследования: 1) Acinetobacter baumannii K70 (изолят SGH080, Сингапур) Повторяющееся звено КПС A. baumannii K70 представляло собой разветвленный тетрасахарид, включающий два остатка L-FucpNAc, один остаток D-FucpNAc и D-GalpNAcA: -3)[aLFucpNAс(1-4]-aDGalpNAcA(1-3)aLFucpNAc(1-3)bDFucpNAc(1- Были подобраны бактериофаги AM24, BS46 и APK09, чьи рекомбинантные деполимеразы хвостовых шипов обладали специфической гликозидазной активностью и расщепляли только одну гликозидную связь, а именно βDFucpNAc(1-4)αDGalpNAcA. Это позволило получить мономер повторяющегося звена: [aLFucpNAс(1-4]-aDGalpNAcA(1-3)aLFucpNAc(1-3)DFucpNAc(1- а также димер: aLFucpNAс(1-4]-aDGalpNAcA(1-3)aLFucpNAc(1-3)bDFucpNAc(1--3)[aLFucpNAс(1-4]-aDGalpNAcA(1-3)aLFucpNAc(1-3)bDFucpNAc(1- Примечательно, что штамм К70 имел идентичную Wzy-полимеразу с Wzy-полимеразой из штамма A. baumannii К9, хотя инициирующие сахара у них были разные – DFucpNAc и βDGlcpNAc, соответственно. Полногеномное секвенирование и поиск альтернативной полимеразы показал, что таковых у двух штаммов не имеется. Таким образом, получалось, что Wzy_К9-полимераза обладает бифункциональной активностью, а различие в структурах определялось тем, что в KL-локусе K70 имеются гены биосинтеза DFucpNAc. Кроме того, выяснилось, что деполимеразы фагов AM24, BS46 и APK09 (как предполагалось, специфичные для К9), также могут расщеплять два типа связей - βDFucpNAc(1-4)αDGalpNAc (в к70) и βDGlcpNAc(1-4)αDGalpNAcA (в К9). 2) Acinetobacter baumannii K3-v1 (изолят AB5001). Структура капсульного полисахарида K3-v1 была установлена и в его составе, кроме обычных моносахаридов, была обнаружена нестехиометрически O-ацетилированная по положению (4) 2,3-диацетамидо-2,3-дезокси-D-глюкуроновая кислота (D-GlcNAc3NAcA) в боковой цепи: -3)[bDGlcNAc3NAcA4OAc(1-4)]aDGalp-(1-6)bDGlcp(1-3)bDGalpNAc-(1- КПС A. baumannii K3-v1 был структурно схож с ранее установленным КПС A. baumannii K3, имеющим пентасахаридное повторяющееся звено: -3)[bDGlcNAc(1-6)][bDGlcNAc3NAcA4OAc(1-4)]aDGalp-(1-6)bDGlcp(1-3)bDGalpNAc-(1- Отличие заключалось в отсутствии в КПС K3-v1 бокового остатка bDGlcNAc, что связано с делецией гена Gtr6 в кластере биосинтеза K3-v1, ответственного за перенос бокового остатка D-GlcpNAc в K3. 3) Acinetobacter baumannii K135 (изолят RES-546). Особенностью КПС многих типов A. baumannii является присутствие изомеров 5,7 диамино-3,5,7,9-тетрадезоксинон-2-улозоновой кислоты. Три из них – ацинетаминовая кислота (L глицеро-L-альтро-изомер), 8-эпиацинетаминовая кислота (D глицеро-L-альтро-изомер) и 8 эпипсевдаминовая кислота (D-глицеро-L-манно-изомер) – в природных углеводах других видов бактерий до настоящего времени не обнаружены. В ходе выполнения данного этапа проекта, мы полностью аннотировали генный кластер биосинтеза штамма RES-546, который соответствовал установленной химической структуре повторяющегося звена КПС, включая первый инициирующий моносахарид: [8ePse5Ac7Ac-(2-6)aGal](-3)aDGlcpNAc(1-3)bDGlcpNAc-(1- Структура была подтверждена также расщеплением по Смиту и была выделена отдельная основная цепь и гликозид b-8ePse5Ac7Ac-(2-1)-Gro. Гликозид с незамещенной 8ePse5Ac7Ac помог точно подтвердить абсолютную конфигурацию высшего сахара. Гена ответственного за биосинтез эпимеразы, способной на конверсию Pse5Ac7Ac в 8ePse5Ac7Ac на данном этапе выявить не удалось. Вероятно, он находится в хромосоме вне кластера. 4) Фаговые деполимеразы семейства Friunavirus и их специфичность к гликозидным связям В данной части нашей работы были подробно изучены гликозидазы хвостовых шипов фриуновирусов APK09, APK14, APK16, APK86, APK127v, APK128 и APK37.1. Гены гликозидазы были экспрессированы в плазмиде в векторах на основе Escherichia coli B834, синтезированные белки были очищены и использованы для обработки КПС штаммов K9, K14, K16, K37/K3-v1, K86, K127 и K128. Все полученные олигосахариды (мономеры, димеры и тримеры повторяющихся звеньев КПС) были выделены и охарактеризованы, также были установлены гликозидные связи, по которым шло расщепление, а именно: b-D-GlcpNAc-(1-3)-а-D-GalpNAcA (К9, фаг APK09) a-D-GalpNAc-(1-4)-b-D-GalpNAc (K14, фаг APK14) b-D-Galp-(1-3)-b-D-GalpNAc (K16, фаг APK16) b-D-GalpNAc-(1-3)-a-D-Galp (K37б фаг APK37.1) b-D-GalpNAc-(1-3)-a-D-Galp (K3-v1, фаг K3-v1) b-D-GalpNAc-(1-3)-a-L-Rhap (K86, фаг APK86) b-D-GalpNAc-(1-3)-a-D-Galp (K127, фаг APK127v) b-D-GalpNAc-(1-4)-a-D-Galp (K128, фаг APK128) Высочайшая специфичность фаговых деполимераз открывает широкие перспективы, например, для синтеза гликонъюгатов но основе олигосахаридов КПС и нейтрального белка-носителя, которые можно использовать в качестве вакцинных препаратов. Полученные на этапе 2023 года данные были представлены нами в пяти статьях, включая обзор, с упоминанием о поддержке Фонда РНФ.