КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-14-00294

НазваниеСистемы геномного редактирования CRISPR/Cas9 c регуляцией активности на уровне направляющей РНК

РуководительНовопашина Дарья Сергеевна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2022 г. - 2024 г.

Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словаСистема геномного редактирования CRISPR/Cas9, регуляция активности, аллостерическая регуляция, аптамеры, фоторегуляция, фоточувствительные остатки, химический синтез РНК, модификации, циклизация

Код ГРНТИ34.15.15 34.15.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Система геномного редактирования CRISPR/Cas 9 в настоящее время широко используется для решения разнообразных молекулярно-биологических и генно-инженерных задач. Усовершенствование этого универсального инструмента воздействия на генетический материал в плане точности и эффективности работы является актуальной научной проблемой. Одним из подходов к ее решению является создание регулируемых во времени и пространстве систем CRISPR/Cas9 под действием различных стимулов, таких как, облучение светом определенной длины волны или присутствие определенных молекул. Проект представляет собой комплексное исследование, включающее в себя создание регулируемых на уровне направляющих РНК систем редактирования генома, чью активность можно регулировать путем облучения или с использованием малых молекул (аллостерическая регуляция), систематическое исследование эффективности и регулируемости созданных систем в модельной системе. В ходе выполнения проекта будут разработаны новые подходы для созданию фоточувствительных направляющих РНК, созданы новые варианты химерных направляющих РНК, содержащих аптамеры в своем составе, а также модельные системы для исследования систем редактирования генома CRISPR/Cas9. Коллектив авторов проекта объединяет специалистов в областях химии нуклеиновых кислот, их производных и конъюгатов, органического синтеза, молекулярной и клеточной биологии, химического синтеза РНК и ДНК аптамеров и исследования их свойств. Междисциплинарность коллектива исполнителей и имеющийся у них значительный научно-методический задел адекватны всем поставленным в проекте задачам, что позволяет рассчитывать на выполнение работ по проекту в полном объеме и получение результатов мирового уровня. В ходе выполнения проекта в 2022-2024 гг. планируется опубликовать 8 статей в журналах, индексируемых в Web of Science и Scopus. Планируется также представление полученных результатов на международных конференциях.

Ожидаемые результаты
Будут получены фоточувствительные направляющие РНК (crРНК, tracrРНК и sgРНК), содержащие фоточувствительные группы различных типов, в различных положениях олигонуклеотидной цепи, а также вспомогательные фоточувствительные олигонуклеотиды для регуляции систем геномного редактирования. На основе сравнительного анализа способности систем геномного редактирования, содержащих фотомодифицированные направляющие РНК или вспомогательные олигонуклеотиды, изменять свою активность под действием облучения в модельных системах будут выбраны наиболее перспективные варианты для использования в молекулярной биологии. Будет проведен дизайн и получены направляющие РНК, содержащие в своем составе аптамеры к малым молекулам, конформацию которых можно будет регулировать аллостерическим путем. Будет проведено детальное исследование аллостерической регуляции систем геномного редактирования, содержащих направляющие РНК с внедренными в их структуру аптамерами, в модельных системах. Будут выбраны оптимальные варианты систем геномного редактирования регулируемых (включаемых/выключаемых/переключаемых) малыми молекулами. Теоретический и экспериментальный уровень ожидаемых результатов проекта соответствует современному мировому уровню, а по ряду позиций опережает аналогичные разработки в России и за рубежом в данной области науки.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Нами разработан подход к синтезу фоторасщепляемых циклических РНК. Проведено исследование их линеаризации под действием облучения. С использованием разработанного метода нами получены серии фоторасщепляемых циклических направляющих РНК (crРНК) и их 2’-модифицированные аналоги и продемонстрирована возможность активации системы геномного редактирования путем облучения светом. Продемонстрировано снижение нецелевых (off-target) эффектов при использовании 2’-фтор- и LNA-модифицированных направляющих crРНК. Синтезированы вспомогательные блокирующие циклические олигорибонуклеотиды и олигодезоксирибонуклеотиды и показана возможность ингибирования действия системы редактирования генома путем УФ-облучения. На основе литературных данных для введения с состав направляющих РНК на данном этапе выбран аптамер к теофиллину. Проведен дизайн и синтез двух вариантов направляющих crРНК и одной tracrРНК с этим аптамером, которые должны активировать систему в присутствии теофиллина, и tracrРНК с аптамером, которая должна деактивировать систему CRISPR/Cad9 в присутствии теофиллина. Показано, что при использовании созданных активируемых теофиллином направляющих РНК расщепление плазмидной ДНК-мишени происходит с значительно меньшей эффективностью, чем для контрольных не модифицированных направляющих РНК. При использовании tracrРНК, которая должна дезактивироваться в присутствии теофиллина, эффективность действия в отсутствии теофиллина не хуже, чем у контрольной не модифицированной системы. Начатое в данном проекте комплексное сравнительное исследование позволит создать системы геномного редактирования, активность которых можно будет включать, выключать или переключать путем облучения света, а также системы геномного редактирования с аллостерической регуляцией на уровне направляющих РНК.

Публикации

1. Саковина Л.В., Вохтанцев И.П., Воробьева М.А., Воробьев П.Е., Новопашина Д.С. Specificity of CRISPR/Cas9 System by Selective Modification of Guide RNAs with 2′-fluoro and Locked Nucleic Acid Nucleotides International Journal of Molecular Sciences., 2022. V.23. N.21. P.13460. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms232113460

2. Горленко Е.С., Саковина Л.В., Новопашина Д.С. Фоточувствительные олигонуклеотиды как инструмент регуляции активности системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА. Материалы всероссийской конференции, СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА. Материалы всероссийской конференции. Новосибирск, 2022. С.168 (год публикации - 2022)

3. Иванcкая Е. В., Саковина Л. В., Горленко Е. С., Вохтанцев И. П., Новопашина Д. С. Циклические направляющие РНК для создания фотоактивируемой системы CRISPR/Cas9. X Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков — 2022: Cб. тез. / АНО «Иннов. центр Кольцово». Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2022, Сборник тезисов. IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков OpenBio-2022 (Наукоград Кольцово, 2022). С.160-161. (год публикации - 2022)

4. Иванcкая Е.В., Саковина Л.В., Горленко Е.С., Вохтанцев И.П., Новопашина Д.С. Циклические направляющие РНК как компоненты фоторегулируемой системы геномного редактирования CRISPR/Cas9. СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА. Материалы всероссийской конференции. Новосибирск, 2022 Издательство: ООО «Офсет-ТМ»., Синтетическая биология и биофармацевтика. Материалы всероссийской конференции (Новосибирск, 24–28 июля 2022 г.). С.182 (год публикации - 2022)

5. Саковина Л. В., Вохтанцев И. П., Новопашина Д. С. Модифицированные направляющие РНК для создания специфичной и регулируемой системы CRISPR/Cas9. IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков — 2022: Cб. тез. / АНО «Иннов. центр Кольцово». Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2022, Сборник тезисов. IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков OpenBio-2022 (Наукоград Кольцово, 2022). С.656. (год публикации - 2022)

6. - В России модифицировали систему геномного редактирования Сайт РНФ. Новости., - (год публикации - )

7. - В России модифицировали систему геномного редактирования 2. ТАСС. Наука., - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Система геномного редактирования CRISPR/Cas 9 в настоящее время широко используется для решения разнообразных молекулярно-биологических и генно-инженерных задач. Усовершенствование этого универсального инструмента воздействия на генетический материал в плане точности и эффективности работы является актуальной научной проблемой. Одним из подходов к ее решению является создание регулируемых во времени и пространстве систем CRISPR/Cas9 под действием различных стимулов, таких как, облучение светом определенной длины волны или присутствие определенных молекул. В 2023 году нами осуществлен дизайн и синтез переключаемых систем CRISPR/Cas9, содержащих направляющие РНК с фоточувствительными линкерами на основе азобензола и способные изменять свою конформацию при облучении светом определенной длины волны. Получены фоторасщепляемые 2'-модифицированные направляющие crРНК, способные после облучения инактивировать систему геномного редактирования и проявляющие большую специфичность по отношению к ДНК-мишени. Офф-таргет эффект (нецелевое расщепление ДНК) для таких систем значительно ниже, чем для их аналогов, не содержащих фоторасщепляемый линкер. Нами созданы аллостерически регулируемые системы CRISPR/Cas9 с направляющими РНК, содержащими в своем составе аптамер к теофиллину. На данном этапе нам удалось получить системы, которые инактивируются в присутствии теофиллина.

Публикации

1. Е.А. Ахметова, И.П. Вохтанцев, М.И. Мещанинова, М.А. Воробьева, Д.О. Жарков, Д.С. Новопашина ФОТОРАСЩЕПЛЯЕМЫЕ НАПРАВЛЯЮЩИЕ РНК ДЛЯ ФОТОРЕГУЛИРУЕМОЙ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS9 Биоорганическая химия, - (год публикации - 2024)

2. Горленко Е.С., Саковина Л.В., Новопашина Д.С. Фоторегулируемые системы редактирования генома CRISPR/Cas9 с использованием циклических фоторасщепляемых олигонуклеотидных компонентов. Материалы конференции III Студенческий биохимический форум, Материалы конференции III Студенческий биохимический форум (12-13 марта 2023г, МГУ, Москва). Том I. C.51-52. (год публикации - 2023)

3. Горленко Е.С., Саковина Л.В., Новопашина Д.С. Создание фоторегулируемых систем редактирования генома CRISPR/CAS9 с использованием циклических фоторасщепляемых олигонуклеотидов. Сборник научных трудов III Всероссийская научная конференция с международным участием «Оптогенетика+ 2023» и школа по современным методам неинвазивного контроля нейрональной активности (6–8 апреля 2023 года, Санкт-Петербург)., Сборник научных трудов III Всероссийская научная конференция с международным участием «Оптогенетика+ 2023» и школа по современным методам неинвазивного контроля нейрональной активности (6–8 апреля 2023 года, Санкт-Петербург). (год публикации - 2023)

4. Должикова О. А., Семиколенова О. А., Мещанинова М. И., Новопашина Д. С. Аллостерическая регуляция CRISPR/CAS9 системы на уровне РНК. Сборник тезисов X Международной конференции молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов и молекулярных биологов. OpenBio-2023. (Новосибирск, Наукоград Кольцово, 26-29 сентября 2023)., Сборник тезисов X Международной конференции молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов и молекулярных биологов. OpenBio-2023. (Новосибирск, Наукоград Кольцово, 26-29 сентября 2023). С.124-125. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.25205/978-5-4437-1526-1-71

5. Должикова О.А., Мещанинова М.И., Новопашина Д.С. Создание CRISPR/Cas9 системы с возможностью аллостерической регуляции на уровне направляющей РНК. Гены и клетки, Материалы Конгресса “CRISPR-2023” 11-13 сентября 2023. Гены и клетки, 2023, Т. XVIII, Приложение, C.66. (год публикации - 2023)

6. Е.С. Горленко, Л.В. Саковина, Е.В. Иванская, Д.С. Новопашина Подходы к фоторегулируемому направленному расщеплению ДНК нуклеазой Cas9 с использованием фотомодифицированных олигонуклеотидов. X съезд российского фотобиологического общества и конференция «Современные проблемы фотобиологии». Материалы съезда., X съезд российского фотобиологического общества и конференция «Современные проблемы фотобиологии». Материалы съезда. С. 171-172. (год публикации - 2023)

7. Новопашина Д.С., Саковина Л.В., Горленко Е.С., Иванская Е.В., Должикова О.А., Мещанинова М.И. Подходы к регуляции системы CRISPR/Cas9 на уровне направляющей РНК. Гены и клетки, Подходы к регуляции системы CRISPR/Cas9 на уровне направляющей РНК. Материалы Конгресса “CRISPR-2023” 11-13 сентября 2023. Гены и клетки, 2023, Т. XVIII, Приложение, C.30. (год публикации - 2023)

8. Саковина Л.В., Ахметова Е.А., Новопашина Д.С. 2'-Модифицированные фоторасщепляемые направляющие РНК для системы CRISPR/Cas9 с улучшенными характеристиками. Гены и клетки, Материалы Конгресса “CRISPR-2023” 11-13 сентября 2023. Гены и клетки, 2023, Т. XVIII, Приложение, C.84. (год публикации - 2023)

9. Саковина Л.В., Горленко Е.С., Вохтанцев И.П., Семиколенова О.А., Агалакова Е.В., Мещанинова М.И., Новопашина Д.С. Регулируемые на уровне направляющей РНК системы CRISPR/Cas9. Регулируемые на уровне направляющей РНК системы CRISPR/Cas9. Материалы 13-ой Международной научной конференции «Биокатализ. Фундаментальные исследования и применения» (БИОКАТАЛИЗ - 2023)., Регулируемые на уровне направляющей РНК системы CRISPR/Cas9. Материалы 13-ой Международной научной конференции «Биокатализ. Фундаментальные исследования и применения» (БИОКАТАЛИЗ - 2023), Суздаль, 2023. С.115. (год публикации - 2023)