КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-14-00247
НазваниеРазработка новых подходов для исследования механизмов пространственной организации хроматина и их функционального значения в регуляции генной экспрессии у животных
РуководительФишман Вениамин Семенович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук", Новосибирская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика
Ключевые слова3D-геномика, хроматин, эпигенетика, экструзия петель, сбалансированные хромосомные перестройки, Hi-C, редактирование генома, геномика насекомых
Код ГРНТИ34.15.15
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Укладка ДНК в животной клетке имеет неслучайную природу и позволяет не только решить задачу компактизации генома, но и участвует в регуляции его активности. Понимание механизмов, определяющих укладку хроматина и связей между трехмерным уровнем организации генома и его экспрессией критически необходимо для расшифровки эпигенетической системы, контролирующей развитие и жизнедеятельность живых организмов.
Открытие механизмов образования хроматиновых петель путем экструзии и формирования белковых конденсатов за счет жидкостно-жидкостной фазовой сепарации позволили в значительной степени описать наблюдаемую у животных картину хроматиновых контактов. Однако понимание функционального значения трехмерной архитектуры генома остается неполным. Несмотря на поразительную эволюционную консервативность петлевых доменов хроматина у позвоночных животных, нарушения их структуры не всегда проявляются фенотипически и в ряде случаев имеют лишь ограниченный эффект на экспрессию генов. В то же время примеры других работ убедительно показывают, что изменения топологии петель хроматина в результате мутаций в определенных ситуациях могут приводить к нарушениям генной экспрессии и развитию заболеваний. Таким образом остается неясным, от чего именно зависят эффекты, вызванные нарушениями организации хроматина.
Ещё одна загадка связана с разницей в организации хроматина позвоночных и беспозвоночных животных. У последних формирование топологических доменов, вероятно, вообще не связано с процессом экструзии петель. Молекулярные механизмы, объясняющие различия в организации хроматина между таксонами, а также их функциональное значение, остаются не выясненными.
Процессы, лежащие в основе компартментализации хроматина, изучены ещё менее полно. Возможность образовывать конденсаты экспериментально показана лишь для нескольких белков эу- и гетерохроматина. Неизвестно, как эти белки могут взаимодействовать друг с другом — например, насколько эффективно различные белки эухроматина взаимодействуют между собой и с хроматином; сколько различных конденсатов может образовываться в ядре животной клетки; как нарушения в первичной структуре белков влияют на их способность формировать конденсаты. В целом, наши представления о белок-белковых взаимодействиях в ядре и их роли в укладке генома фрагментарны и требуют расширения.
Помимо фундаментальных вопросов, бурное развитие методов 3D-геномики сформировало и ряд прикладных направлений, основанных на применении современных технологий анализа укладки хроматина. Методы захвата конформации хромосом недавно были адаптированы для детекции хромосомных перестроек и сборки геномов. Появление протоколов анализа индивидуальных клеток открывает новые возможности для использования этих методов в диагностике геномных заболеваний человека в тех случаях, когда материал, доступный для анализа, ограничен в количестве.
Мы предлагаем комплексный проект, направленный на решение этих и других актуальных проблем в области 3D-геномики. В проекте используются самые современные генетические технологии: редактирование геномов клеточных линий, получение и анализ генетически-модифицированных животных, методы захвата конформации хромосом и массового параллельного секвенирования. Эти технологии будут применены для проверки сформулированных за последние годы гипотез о функциональном значении трехмерной организации хроматина с использованием разработанных нами уникальных животных моделей. Кроме проверки существующих гипотез, мы разработаем новые скрининговые технологии, направленные на поиск генетических детерминант трехмерной архитектуры ДНК. Наконец, в рамках проекта методы анализа трехмерных контактов хроматина будут адаптированы для детекции хромосомных патологий в преимплантационной диагностике эмбрионов человека, что позволит, в случае успеха, решить одну из важных задач в медицинской генетике.
Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта мы ожидаем получить новую информацию о механизмах, регулирующих трехмерную укладку генома животных и функциональном значении этих механизмов с точки зрения регуляции генной экспрессии. В ходе решения сформулированных в заявке задач мы:
- определим как клеточно-специфические различия в эпигенетическом ландшафте влияют на регуляторный эффект мутаций в границах топологически ассоциированных доменов;
- установим какие cis-регуляторные последовательности определяют профиль компартментализации хроматина;
- определим, как эволюция архитектурных белков хроматина, участвующих в процессе экструзии петель, связана с появлением петлевых доменов у позвоночных животных;
- установим, какие эпигенетические механизмы задействованы в формировании удаленных петлевых взаимодействий в геномах комаров рода Anopheles.
Кроме этого, мы разработаем новые методы и технологии, включая методы массового скринига нуклеотидных последовательностей, которые позволят оценивать эффект цис-регуляторных вариантов на компартментализацию ДНК. Мы также разработаем технологию детекции сбалансированных хромосомных перестроек в единичных клетках на основе метода захвата конформации хромосом. Эта технология может в дальнейшем применяться в преимплантационном скрининге эмбрионов человека для решения актуальных задач медицинской генетики.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках отчетного периода мы работали над несколькими направлениями исследований.
Во-первых, мы использовали несколько мышиных моделей для функциональной характеристики границ топологически ассоциированных доменов в геномах животных. Анализ транскриптома и экспрессии отдельных генов позволил установить взаимосвязь между делециями или инверсиями сайтов связывания CTCF в границах ТАДов и изменением экспрессии генов Slc29a3, Unc5b, Vsir, c-kit, kdr, Nrep, Apc, Epb4al4a, Lrrtm2 в различных органах и тканях. Полученные данные показывают, что делеция границ ТАДов не только приводит к изменению активности соседних генов, но и может влиять на такой важный, с точки зрения эволюции животных в естественных условиях, фенотипический признак, как окраска животных.
Во-вторых, мы провели эволюционное сравнение белковых последовательностей фактора CTCF и показали, как изменения в N-концевом домене белка могут быть связаны с эволюцией системы экструзии петель хроматина у животных.
В-третьих, мы впервые попробовали использовать 3С-технологии для детекции контактов плазмидной ДНК с хроматином. Мы показали, что такой нестандартный подход для анализа предпочтений в распределении плазмидной ДНК в ядре в принципе возможен, но разработанная система требует дальнейшей оптимизации.
В-четвертых, мы исследовали ткане- и клеточно-специфичность формирования длинных хроматиновых петель на хромосоме Х у комаров рода Anopheles. Мы показали, что петли формируются в различных органах и тканях, не зависимо от пола животных. Для дальнейших исследований создана клеточная, которая позволит изучать функциональную роль последовательностей ДНК, формирующих петлевые взаимодействия, на основе методов редактирования генома.
В-пятых, мы разработали протокол детекции контактов хроматина, применимый для небольшого числа клеток (от нескольких десятков до 3-4 клеток) и апробировали этот протокол на ИПСК и лимфоцитах человека. Мы показали, что полученные карты контактов хроматина характеризуются высокими метриками качества, а их визуальный анализ позволяет обнаружить паттерны, характерные для хромосомных перестроек. Таким образом, нами разработан протокол для сборки Hi-C библиотек из материалов биоптата и эмбрионов человека.
Публикации
1. Весна Э., Фишман В.С. FastContext: A tool for identification of adapters and other sequence patterns in next generation sequencing (NGS) data Vavilov Journal of Genetics and Breeding, 26,8 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.18699/VJGB-22-00
2. Фишман В.С., Пиндюрин А.В. Editorial: The role of high-order chromatin organization in gene regulation Frontiers in Genetics, 13:1045787 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3389/fgene.2022.1045787
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках второго года выполнения работ по проекту “Разработка новых подходов для исследования механизмов пространственной организации хроматина и их функционального значения в регуляции генной экспрессии у животных” мы получили несколько важных научных результатов. Во-первых, были охарактеризованы транскрипционные эффекты, вызванные делецией и инверсией границы ТАДа в локусе Epb41l4a мыши. Предложена гипотеза, объясняющая проявления синдромальной умственной отсталости у пациентов со структурными перестройками, затрагивающими эту границу ТАДов. Этот результат важен для интерпретации медико-генетических анализов у пациентов с умственной отсталостью.
Нами детально описана роль трехмерных контактов хроматина в регуляции генов Kit/Kdr/Pdgfra. Ген Kit - хорошо известный регулятор развития, который влияет на окраску животных и функционирование стволовых кроветворных клеток. Ген Pdgfra - известный онкоген, его нарушения наблюдаются в значительной доле глиом. Обнаруженные нами регуляторные механизмы могут быть интересны врачам-онкологам и специалистам в области генетики развития.
Нами получен клеточный материал от пациентов с наследственными заболеваниями, связанными с нарушением укладки хроматина. Группа пациентов включает семьи с наследуемой дупликацией гена STAG2 и делецией границы ТАДа между генами SIX2 и SIX3.
Нами предложен метод для детекции небольших транскрипционных изменений, вызванных мутациями cis-регуляторных элементов. Метод основан на анализе аллельного дисбаланса у гибридных мышей.
Мы разработали и охарактеризована систему экспрессии белка CTCF в клетках HCT116-CTCF-mAC. В этих клеток геном встроено несколько конструкций, активность которых позволяет деградировать эндогенный белок CTCF при добавлении в среду для культивирования индуктора (5ph-IAA). Такие модельные системы могут быть использованы для изучения “острых” эффектов деградации белка - например, когда традиционные способы “удаления” белка их клетки путем нарушения кодирующего белок гена являются летальными.
Нами создана коллекция генетических векторов ортологов гена CTCF семи видов животных.
Получен набор эпигенетических и транскриптомных профилей для линии клеток комаров Anopheles stepensi. Охарактеризована частота возникновения CRISPR/Cas9-опосредованных мутаций в этих клетках.
Публикации
1. Гридина М., Попов А., Шадский А., Торгунаков Н., Кечин А., Храпов Е., Рыжкова О., Филипенко М., Фишман В. Expanding the list of sequence-agnostic enzymes for chromatin conformation capture assays with S1 nuclease Epigenetics and Chromatin, 16(1):48 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1186/s13072-023-00524-4
2. Хабарова А., Кокшарова Г., Сальников П., Белокопытова П., Мунгалов Р., Пристяжнюк И., Нурисламов А., Гридина М., Фишман В. A Cre-LoxP-based approach for combinatorial chromosome rearrangements in human HAP1 cells Chromosome Research, 31(1):11 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s10577-023-09719-7
3. Кабирова Э., Нурисламов А., Шадский А., Смирнов А., Попов А., Сальников П., Баттулин Н., Фишман В Function and Evolution of the Loop Extrusion Machinery in Animals Int J Mol Sci, 24(5): 5017 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms24055017