Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Твердофазный ИФА с колориметрической регистрацией является одним из наиболее часто используемых вариантов ИФА. В ходе анализа на твердой поверхности последовательно собирается «сэндвич» из антител захвата, анализируемого антигена и конъюгата вторых антител с ферментной меткой, чаще всего пероксидазой хрена. Далее в ходе ферментативной реакции из бесцветного субстрата нарабатывается окрашенный продукт, и его оптическое поглощение является мерой концентрации анализируемого антигена. Одним из факторов, ограничивающих чувствительность ИФА, является возможности системы регистрации. Для клинических применений задача снижения пределов обнаружения систем регистрации в ИФА является актуальной на многие годы вперед, поскольку возможность определения более низких концентраций антигенов (маркеров) значительно расширяет их спектр. Гигантское комбинационное рассеяние (ГКР) – это эффект усиления колебательного спектра молекулы, находящейся вблизи наноструктурированных металлических поверхностей, т.н. ГКР-субстратов. Спектроскопия ГКР в последние 15 лет широко применяется в качестве высокочувствительной системы регистрации для различных аналитических методик. На первом году выполнения проекта разработан прототип системы детектирования пероксидазной метки на основе ГКР. В ней используется реакция ферментативного окисления о-фенилендиамина до 2,3-диаминофеназина и золи серебряных наночастиц в качестве ГКР-субстрата. Достигнутый предел обнаружения пероксидазы (0.03-0.05 пмоль/л) улучшен по сравнению со спектрофотометрией: на 2 порядка по сравнению с системой с тем же субстратом и в 3-5 раз по сравнению с колориметрической системой с коммерческой стабилизированной однокомпонентной субстратной смесью на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидина. Дополнительным преимуществом ГКР регистрации является малый требуемый объем образца, типично составляющий 20 мкл.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Ключевой задачей первого года выполнения проекта была принципиальная демонстрация возможности высокочувствительной регистрации активности пероксидазы с использованием ГКР, для чего методом проб, ошибок и оптимизаций были найдены условия ГКР измерения 2,3-диаминофеназина (ДАФ) на фоне значительно превосходящих количеств непрореагировавшего субстрата, о-фенилендиамина (оФД). Было показано, что ключевым фактором чувствительности ГКР регистрации является pH. На втором году проводились работы по углубленному изучению процессов и закономерностей в этой системе. Было показано, что чувствительность снижается при pH <3 за счет перехода регистрируемой протонированной формы ДАФ в дважды протонированную. При pH > 3.5 наблюдается конкуренция между оФД и ДАФ за связывание с поверхностью серебра. Это происходит по причине прочного связывания нейтральной формы оФД с поверхностью серебра за счет образования, по меньшей мере, одной ковалентной донорно-акцепторной связи N-Ag. Таким образом, эмпирически найденный на первом году pH = 3 является оптимальным для ГКР регистрации, и данный оптимум единственный. И хотя данный цикл работ не привел к дополнительному улучшению системы, он предоставил прочный химический и физико-химический базис для эмпирически найденного ранее прототипа аналитической системы. Помимо фундаментальных исследований стадии ГКР регистрации, проводились плановые работы по оптимизации стадии ферментативной реакции в данной системе. Было показано, что переход от используемого ранее фосфатного буфера с pH = 6 к цитратному буферу с pH = 4 или 5 позволяет вдвое повысить скорость ферментативной реакции, одновременно снизив скорость мешающего фонового окисления оФД. Вторым большим направлением проекта на втором году являлся скрининг других пар продукт-фермент на предмет возможности их высокочувствительной регистрации методом ГКР. Для 2- и 4-нитрофенолов, продуктов ферментативных реакций гидролиза фосфорных эфиров и бета-галактозидов под действием ферментов щелочной фосфатазы и бета-галактозидазы соответственно, была показана невозможность их прямой ГКР регистрации с использованием серебряных наночастиц, стабилизированных хлоридом. Показана принципиальная возможность ГКР детектирования 4-нитрофенола в виде фенолята путем перезарядки поверхности частиц при помощи полиэтиленимина. Однако рабочий диапазон (от 0.1 мМ и выше), полученный при первичном скрининге, на 4-5 порядков выше требуемой чувствительности. Для 2- и 4-нитроанилинов, продуктов неканонической реакции нитрования, катализируемой пероксидазой в присутствии нитрита, было показано, что их прямая ГКР регистрация в кислой среде невозможна, в щелочной среде при концентрациях порядка 0.1-1 мМ регистрируются спектры ГКР продуктов их фотохимических превращений под действием лазера спектрометра КР, что также невозможно использовать для разработки аналитической методики. Также была изучена возможность использования трех структурных аналогов оФД (2,3-диаминопиридина, 3-нитро-1,2-фенилендиамина и 2,3-диаминотолуола) в качестве субстратов пероксидазы для ее спектрофотометрического и ГКР измерения. Принципиально было показано, что все три соединения являются субстратами пероксидазной реакции. Толуольное производное по многим параметрам (спектры поглощения и ГКР субстрата и продукта, эффективная константа Михаэлиса) является прямым аналогом оФД. Однако дальнейшее использование этих соединений в проекте является нецелесообразным. Для 2,3-диаминотолуола и особенно 2,3-диаминопиридина - по причине низкой чистоты коммерчески доступных препаратов, для 3-нитро-1,2-фенилендиамина – ввиду низкой растворимости в нейтральных средах.