Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект направлен на разработку и применение новой методологии оценки эпигенетических модификаций гистонов на уровне единичных живых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. В основе лежит идея генетически кодируемых сенсоров эпигенетических ландшафтов (СЭЛ) для визуализации паттернов распределения целевой модификации. СЭЛ включают в себя природные “читающие” домены (histone modification reader domains, HMRD), определяющие специфичность связывания, и флуоресцентный белок для визуализации в живых клетках. Данная оригинальная методология применяется для изучения процесса дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (иПСК) в нейрональные клетки. В первый год выполнения проекта были проведены работы по следующим основным направлениям: 1. Создание СЭЛ на H3K27ac. Для создания СЭЛ, специфичного к модификации гистона H3K27ac (Н3, ацетилированный по лизину-27) были протестированы несколько природных HMRD, по литературным данным специфически связывающиеся с данной модификацией. Для каждого эпигенетического домена были созданы три типа химерных белков: 1) Одна копия HMRD с мономерным флуоресцентным белком - [HMRD]-[мономерный флуоресцентный белок]. 2) Две копии HMRD с мономерным флуоресцентным белком - [HMRD]-[мономерный флуоресцентный белок]-[HMRD]. 3) Одна копия HMRD с димерным дальнекрасным флуоресцентным белком Katushka - [HMRD]-[Katushka]. Наилучшие результаты по формированию внитриядерных паттернов флуоресценции показали конструкции типа 3. 2. Математический анализ эпигенетических паттернов H3K9me3 и H3K9ac. Для улучшенного анализа изображений эпигенетических сенсоров создан протокол устранение размытия и шума, основанный на известных алгоритмах деконволюции и функции рассеяния точки. Оптимизирован протокол сегментации ядер и пространственно-временного трекинга индивидуальных ядер в сериях последовательных изображений. Решена задача классификации изображений эпигенетических сенсоров с помощью методов машинного обучения. 3. Создание линии иПСК с индуцируемой экспрессией ATOH1. Было протестировано два метода получения индуцируемой экспрессией ATOH1 в иПСК. В первом подходе использовали Tet-On систему индукции экспрессии, во втором - запуск экспрессии путем трансдукции клеток лентивирусом с ATOH1 под контролем конститутивного промотора CMV. Обнаружено, что в нашей экспериментальной системе первый метод является неэффективным, в то время как второй дает желаемую экспрессию ATOH1, что приводит к дифференцировке иПСК в нейрональные клетки в течение 4-х дней. Продемонстрирована нейрон-подобная морфология получаемых клеток и экспрессия в них нейрон-специфического варианта тубулина TUBB3. 4. Создание линии иПСК с сенсорами на H3K9me3 и/или H3K9ac. Получены стабильные линии иПСК, экспрессирующие эпигенетические сенсоры: - MPP8_mNeonGreen_MPP8 (специфичность - H3K9me3). - AF9_Katushka (специфичность - H3K9ac). - MPP8_mNeonGreen_MPP8 + AF9_Katushka. Показано, что клетки данных линий сохраняют статус иПСК по морфологии, пролиферации и экспрессии основных маркеров. Флуоресцентная микроскопия позволяет выявлять паттерны внутриядерного распределения целевых модификаций с живых клетках иПСК. Полученные линии в сочетании с отработанной методикой индукции экспрессии ATOH1 (см. п. 3 выше) будут использованы на следующем этапе проекта для наблюдения за изменениями эпигенетических паттернов в ходе дифференцировки иПСК в нейрональные клетки.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Данный проект направлен на разработку и использование новой стратегии изучения эпигенетических модификаций гистонов на уровне единичных живых клеток - LiveMIEL. Для достижения этой цели мы создаем генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры, позволяющие визуализировать паттерны распределения целевого эпигенетического маркера в ядрах живых клеток. Компьютерный анализ полученных паттернов позволяет классифицировать клетки по их эпигенетическому состоянию. Разрабатываемая технология применяется для анализа эпигенетических перестроек в ходе дифференцировки индуцированных стволовых клеток человека (иПСК) по нейральному пути. В отчетном периоде были получены следующие основные результаты. Из ряда конструкций с различными комбинациями ридерных доменов, имеющих аффинность к модификациям гистона H3K27ac и H3K4me1, была выбрана одна, при экспрессии которой в клеточной линии HEK293T были визуализированы четкие паттерны флуоресценции, вероятно, представляющие эпигенетический ландшафт модификаций, связанных с суперэнхансерами (сочетание эпигенетических маркеров (H3K27ac и H3K4me1). Была проверена возможность создания биспецифических зондов с другими ридерными доменами: YAF9, YEATS2, BRD9 и GAS41 (все были аффинны к H3K27ac), однако ни один из перечисленных доменов в комбинации с DPF3 не позволил получить четко различимых паттернов флуоресценции. Для визуализации пространственного взаимодействия H3K9me3 и H3K9ac мы использовали систему SplitFAST, предназначенную для отображения белок-белковых взаимодействий. Эта система представляет собой разбитый на две части один флуоресцентный репортер, испускающий флуоресценцию при пространственном сближении этих двух частей, к которым могут быть присоединены функциональные белки. При сближении этих функциональных белков сближаются две части SplitFAST, что приводит к возникновению флуоресценции. Мы привязали домены MPP8 и AF9 к разным частям SplitFAST. Например, при связывании MPP8 с H3K9me3 и AF9 с H3K9ac не возникает флуоресценции, за исключением случаев, когда эти две гистоновые модификации пространственно близки друг к другу. Таким образом, точки сближения модификаций H3K9me3 и H3K9ac вызывают флуоресценцию, что позволяет визуализировать эти события. Было создано и протестировано множество плазмид с различным дизайном и эффективностью. Полученные визуализированные паттерны больше напоминали паттерны H3K9me3. Мы предполагаем, что аффинность MPP8 к H3K9me3 выше, и MPP8 с одной частью SplitFAST специфически связывается с этой гистоновой модификацией, захватывая диффузно распределенный AF9 с другой частью SplitFAST. Таким образом, мы показали, что систему splitFAST надо дополнительно модифицировать, чтобы увеличить афинность AF9 к H3K9ac для визуализации точек пространственного сближения H3K9me3 и H3K9ac. Для индукции дифференцировки иПСК в нейрональные клетки мы использовали экспрессию транскрипционного фактора ATOH1. Предварительно нами было показано, что при индуцибельной экспрессии этого фактора в иПСК действительно происходит дифференцировки в нейрональном направлении (Степанов et al. 2023). Однако для последующих экспериментов мы выбрали другую систему экспрессии, сменив индуцибельный TET-On промотор на конститутивный, позволяющий получать более воспроизводимые результаты. Сначала, с помощью лентивирусной трансдукции была получена линия иПСК MPP8-mNeonGreen-MPP8, экспрессирующая ATOH1-t2a-TagBFP2 под конститутивным промотором pGK. Затем, в течение 4 дней производили визуализацию паттернов H3K9me3 (MPP8). Для этого производили съемку клеток в зеленом канале флуоресценции, параллельно подтверждая наличие экспрессии АТОН1 по флуоресценции TagBFP2 в синем канале. Сигнал TagBFP2 обнаруживался через 24 часа после трансдукции, уровень его затем увеличивался, что подтверждало экспрессию ATOH1. Через четыре дня после трансдукции клетки стали приобретать морфологию, близкую к нейронам, с длинными отростками. Специфичность дифференцировки клеток, индуцированных ATOH1, мы подтвердили методом непрямого иммунофлюоресцентного анализа со специфическими антителами против TUBB3 и MAP2. Для подтверждения изменений, идущих в клетках на уровне транскрипции, мы провели ОТ-кПЦР (обратную транскрипцию с количественным ПЦР) и мы обнаружили увеличение нейрональных маркеров (Sox1, MAP2, MSI1) и другие изменения. Полученные данные привели нас к выводу, что iPSC-MPP8-mNeonGreen-MPP8 успешно подвергся ATOH1-опосредованной дифференцировке в индуцированные нейроны. Визуализация с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии дала возможность исследовать динамику эпигенетических изменений в процессе индуцированной дифференцировки. Для каждого момента времени мы записывали 10-30 случайно выбранных полей зрения, снимая процесс в течение 4 дней один раз в сутки. Полученные в ходе микроскопии изображения паттернов H3K9me3 были проанализированы с помощью подхода MIEL. На основе количественного анализа кластерной структуры данных (статистика Хопкинса, анализ коэффициента силуэта, Евклидовы расстояния между центроидами кластеров) было выявлено три значимо различающихся кластера: 1) 0-й день; 2) 1 и 2 день; 3) 3 и 4 день от запуска дифференцировки клеток. Неожиданным результатом явилось то, наибольшие изменения СЭЛ были зарегистрированы в период первых суток наблюдения. Было показано, что Евклидовы расстояния между центроидами кластеров клеток на 1-2 дня дифференцировки наиболее удалены от изначальной точки и данных 3-4 дней. Этот результат побудил нас исследовать отдельно и более подробно период первых суток дифференцировки иПСК в нейральном направлении. Для этого мы осуществили флуоресцентную микроскопию иПСК MPP8-mNeonGreen-MPP8 каждые два часа сразу после индукции ATOH1. Первая попытка съемки иПСК сразу после индукции заключалась в непрерывной съемке в флуоресцентном микроскопе с водяной баней для поддержания 37°C градусов и добавление HEPES для поддержания pH на оптимальном уровне. Однако эти условия оказались недостаточными для сохранения жизнеспособности иПСК, и клетки умирали в процессе съемки. Поэтому было решено проводить съемку каждые два часа. Такой вид съемки оказался достаточно эффективным, и иПСК успешно проходили процесс дифференцировки и претерпевали процесс съемки в течение 24 часов. В результате полученные изображения были обработаны компьютерным анализом, и было выявлено 2 кластера, соответствующих первым 14 часам и 16-24 часам. Кроме того, помимо первых 24 часов, мы визуализировали процесс дифференцировки в течение 7 суток. После 4 дней дифференцировки мы продолжили проводить съемку иПСК клеток еще три дня, достигая 7-дневного периода. Этот процесс оказался сложным из-за того, что в чашках, помимо дифференцированных клеток, оставались недифференцированные иПСК, которые продолжали делиться и образовывать новые колонии. На 5-й и 6-й день чашка полностью заполнялась новыми колониями иПСК. Чтобы решить эту проблему, мы снижали начальное количество иПСК, чтобы к 5-му и 6-му дню количество недифференцированных клеток было минимальным, и они не заполняли чашку. Таким образом, мы смогли провести съемку дифференцировки до 7 суток. Компьютерная обработка данных не выявила новых эпигенетических сдвигов, и клетки с 5-го по 7-й день остались на уровне кластеров, соответствующих 3-4 суткам. Таким образом, с использованием сенсора MPP8-mNeonGreen-MPP8 мы наблюдали две основные волны глобальной перестройки эпигенетического маркера H3K9me3 в ходе 4-дневной ATOH1-индуцированной дифференцировки иПСК в нейроны - на 1-ый и 3-ий дни дифференцировки. Важным итогом является возможность выявления с помощью метода LiveMIEL ранних признаков дифференцировки клеток, которые трудно обнаружить другими методами.