Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. За первый год проекта была исследована цитотоксичность коллекции 2999 соединений в сокультурах клеточных линий опухолевой и неопухолевой этиологии A549_eGFP/VA13_Kat и MCF7_eGFP/MCF10A_Kat. В ходе одноповторного скрининга выбрано 45 веществ, проявлявших селективность токсичности в 2 и более раз в нескольких последовательных протестированных разведениях (4х-5х каждое) как минимум в одной из пар клеточных линий в FCCT-тесте и требующие более детализированного дальнейшего изучения в ходе проекта. Стоит отметить, что некоторые соединения, показавшие селективность в этом первичном скрининге имели схожие структурные каркасы, что говорит о возможности существования у них общего фармакофора. 2. В части работ, посвященной анализу соединений, показавших селективность в ходе задела по проекту можно выделить группы производных пиримидинтрионов, рифампицинов, инденофлуоренов и производных дигидростильбеноида. Для лидерного соединения группы производных индол-пиримидинтрионов обнаружен ~70-кратный индекс селективности против клеток гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 при анализе цитотоксичности в панели 12 клеточных линий. Это соединение само и родственные соединения при поиске по Танимтото>0.9 не подпадало под патентные ограничения. При скрининге свыше семидесяти производных было найдено несколько седлективно действующих соединений, и одно из наиболее селективных, со схожим спектром селективности оказалось известным ингибитором кинезина Eg5 (KIF11), участвующего в организации цитоскелета и являющегося мишенью для разработки противоопухолевых препаратов. Дальнейшее исследование и анализ механизмов этой группы соединений было признано пока нецелесообразным. Для группы производных рифампицина увеличенная серия соединений этого хемотипа была протестированы в FCCT-тесте на обеих сокультурах. Эти данные были использованы для обновления зависимостей структура свойства и выбора пары наиболее селективных молекул. Эти соединения вызывали в клетках апоптоз в концентрации 3 мг/л. Данные теста бактериальной токсичности показали слабую корреляцию с данными токсичности на эукариотических клетках ~0,2-0,4. В связи с этим было решено изучить способность рифампицина и его аналогов подавлять транскрипцию в эукариотических клетках. При обработке клеток рифампицином и его аналогами количества новосинтезированной РНК уменьшались в дозозависимой манере. Уменьшение количества РНК в клетках под действием препаратов в концентрациях 0.6 мг/л, не вызывающих за то же время апоптоз, может свидетельствовать о том, что ингибирование транскрипции является одним из первостепенных клеточных ответов, предшествующих гибели. В качестве ближайших аналогов обнаруженного в ходе задела данного проекта дигидростильбеноида с селективностью в порядок против линии клеток A549 были найдены структурно схожие бербаминовые производные. Они были исследованы на цитотоксичность и индексы селективности в FCCT-тесте. Хотя два из этих соединений обладали интересной селективностью ~6х в сокультуре MCF7_eGFP/MCF10A_Kat, их паттерн цитотоксичности не соответствовал паттерну лидерного дигидростильбеноида, селективного в сокультуре линий A549_eGFP/VA13_Kat. Дигидростильбеноид структурно похож на пару производных комбретастатина, объединенных в цикл, поэтому было исследовано его предполагаемое влияние на полимеризацию тубулина. При анализе иммуногистохимического окрашивания тубулина в клетках после инкубации с препаратом оказалось, что инкубация клеток А549 с этим соединением в концентрации на пол порядка превышающей CC50 не влияет на полимеризацию тубулина в клетках и гипотеза о действии дигидростильбеноида на тубулиновый цитоскелет была отвергнута. Для производного инденофлуорена, которая показывала заметную селективность в FCCT-тесте и высокую цитотоксичность специфично против клеток линии рака простаты LNCAP была проанализирована в FCCT-тесте серия его аналогов. Было выбрано полтора десятка веществ, которые анализировались в панели клеточных линий рака простаты (линии LNCAP, PC3 и 22RV1, а также VA13 для сопоставления данных между различными сериями клеточных тестов) на цитотоксичность и селективность. Было обнаружено снижение почти на порядок действующей концентрации для его производного 65577 с IC50~0.02 мг/л против линии LNCAP при ~5 мг/л действии против VA13. 3. Было исследовано несколько групп de novo синтезированных нашими коллегами соединений, которые предположительно могли обладать противоопухолевым потенциалом. При исследовании серии спирооксиндолов, оказалось, что наиболее цитотоксичные соединения этой серии не показывали селективности и демонстрировали СС50 ~10 мкМ. Хотя это сопоставимо с эффектом цисплатина, для разработки современных препаратов малоприемлемо, исследование этого варианта модификаций спирооксиндолов прекращено. Вторую серию спиросочлененных производных (спирооксиндол-β-лактамов) исследовали на антибактериальную активность и селективную цитотококсичность против опухолевых клеточных линий [10.3390/ijms23126666]. Диспироксиндол-β-лактам 5f показал активность в отношении штамма E.Coli с модифицированной для упрощенного проникновения соединений мембраной. Измеренная затем минимальная ингибирующая концентрация составила 1,30 ± 0,45 мкМ; остальные соединения не проявляли активности даже при высоких концентрациях. Эти соединения были цитотоксичны в раннем микромолярном диапазоне (5-8 мкМ для 5f), но не проявляли избирательности в отношении опухолевых клеточных линий. При исследовании серии кумариновых и фуранокумариновых производных было отмечено производное AOS-22 без фуранового кольца, которое проявляло селективность против клеток MCF7 по сравнению VA13, но, к сожалению, максимальную токсичность это соединение проявляло против линии HEK293T неопухолевой этиологии. При исследовании производных комбретастатинов, семь из них показали избирательную цитотоксичность хотя бы в одной из двух пар линий VA13/A549 или HEK293T/MCF7. Для дальнейшего исследования механизма действия были выделены соединения GK-352 и GK-475 с выраженной цитотоксичностью. Эти соединения оказались несколько более токсичными для клеточных линий опухолевой этиологии. При сравнительно небольшом индексе селективности, в диапазоне концентраций от 100 до 0.1 μM была значительная разница между значениями выживаемости для клеточной линии VA13 и значениями для всех остальных линий. Была показана способность обоих соединений ингибировать полимеризацию тубулина.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Был проведен анализ цитотоксичности и избирательности действия против опухолевых клеток соединений среди 4992 веществ, собранных по хемоинформатическим признакам новизны (дескриптор медхимической эволюции MCE-18). Для этого использовался конкурентный флуоресцентный тест (FCCT-тест) в двух сокультурах: модель рака легкого – сокультура A549_eGFP и VA13_Kat, модель рака молочной железы – сокультура MCF7_eGFP и MCF10A_Kat в формате высокопроизводительного скрининга (ВПС). Было найдено 213 молекул, в FCCT-скрининге преимущественно цитотоксичных против опухолевых клеток. Хемотипы этих молекул в большинстве новые, в частности представители крупнейших кластеров плохо распознаются системами предсказания биоактивности, не показывая общих молекулярных мишеней. При этом выделяются как несколько групп структурно родственных соединений, так и десятки индивидуальных хемотипов. Собрана база данных по FCCT-скринингу структурно разнообразных соединений полученных в ходе задела и в ходе тестов 2022-2023 годов. В ходе проведения анализа в бактериальной репортерной системе был получен список из 76 соединений, которые демонстрировали зону ингибирования 3 мм и более в штаммах облегченным проникновением в клетку или нарушением эффлюкса. Наиболее сильно действующее на бактерии в первичном скрининг соединение F418-0212 оказалось производным ципрофлоксацина. Было показано, что спирооксиндольное производное 29, обладающее избирательным действием против A549, HCT116 и LNCAP, не является специфическим активатором р53, хотя исходное молекулярное моделирование наших коллег демонстрировало возможность связывания соединения 29 с MDM2 для блокирования деградации р53 и обработка соединением р53 положительных и р53-отрицательных клеток показывало тенденцию к большей цитотоксичности в р53-положительных клеток. Исследовали изменения в белковом ландшафте с помощью 2D-электрофореза в белковом геле привело нас к пулу белков, связанных либо с митохондриями, либо с фолдингом белков (в соответствии с Gene Ontology от string-db.org). В совокупности мы можем предположить, что мы видели вторичные эффекты как реакцию на стресс и апоптоз, которые маскировали первоначальные изменения, вызванные 29, при этом свидетельствуя о способности активировать проапоптотические каскады. Была исследована цитотоксическая активность амидов 4-метил-2-оксо-9-фенил-2H-фуро[2,3-h]-хромен-8-карбоновой кислоты, производного кумарина, сочетающего в структуре ядро ангелицина с гетероциклическими фрагментами при амидном атоме азота по отношению к клеточным линиям MCF7, A549, VA-13 и HEK293Т. В отличие от ранее описанных высокотоксичных производных ангелицина с арил- и гетарилкарбонильными заместителями в положении 8, синтезированные амиды демонстрируют в экспериментах in vitro на данных клеточных линиях значения IC50abs в диапазоне 2 — 100 мкМ. Значимым для цитотоксичности этой группы производных является заместитель в положении 5´ ангелицина. Был проанализирован противоопухолевый потенциал азакарбазолов (бензо[4,5]- и тертациклических нафто[20,10:4,5]имидазо[1,2-c]пиримидинона), которые привлекают интерес благодаря описанной для некоторых производных противоопухолевой активности. Хотя несколько исследованных в прошлом году производных были нецитотоксичны, при завершении анализа серии в этом году оказалось, что тетрациклическое производное 5b с двумя аминосодержащими плечами ингибировало метаболическую активность клеток аденокарциномы легкого A549 со значением CC50 3,6 мкМ с селективностью (SI = 17,3) по отношению к иммортализованным фибробластам VA13. Сопоставление его взаимодействия с различными G4, отсутствием изменения экспрессии соответствующих генов при обработке клеток и данными о взаимодействии с дуплексами ДНК демонстрируют, что это соединение имеет специфичность к определенным G4 структурам, но, вероятно, в силу на порядки большей представленности дуплексов в геноме именно интеркаляция, а не модуляция экспрессии онкогена, регулируемой G4, в большей степени определяет спектр его цитотоксичности. В собранной библиотеке тиазолов, бензотиазолов, имидазолов и амидоксимов были обнаружены соединения с селективной и воспроизводимой цитотоксичностью против опухолевых линий клеток, в том числе, после анализа 11 производных в расширенной панели клеточных линий было обнаружена увеличенная по сравнению с VA13 цитотоксичность против HEPG2, PC3, SiHa, U87, A549 и MCF7. Выбранные в ходе ВПС избирательно цитотоксичные вещества были кластеризованы по структуре. Для наиболее селективных соединений в 3 больших кластерах пересечения предсказаний всех трех сервисов Pass, SwissTargetPrediction с SEA для соединений не обнаружены, но для представителей трех групп соединений в двух из трех сервисов в качестве мишени предсказывался STAT3, которого связана с различными видами рака у человека и обычно предполагает плохой прогноз.