Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За полевой сезон 2022 года экспедиции и собраны образцы (керны и хвоя) сосны кедровой сибирской из разных районов Западного Саяна (Природный парк «Ергаки», Саянский перевал (граница Хакасии и Тывы), Ермаковский район Красноярского края Саяно-Шушенский биосферный заповедник). Всего было собрано более 200 образцов. Проведена камеральная обработка (подготовка к измерению) полученных образцов древесины по стандартным методикам дендрохронологии (Cook and Kairiukstis, 1990). В связи с низкой контрастностью годичных колец кедра сибирского (слабым различием окраски ранней и поздней древесины), проводилось контрастирование поверхности окрашиванием цветными маркерами. Перед измерениями радиального прироста на кернах проводилась предварительная датировка и маркировка колец. Подсчет колец производился под бинокулярным микроскопом STEMI 2000-C при увеличении в 20-80 раз. Измерения ширины годичных колец (TRW) производились на полуавтоматической измерительной установке LINTAB 5 при помощи специализированного программного пакета TSAP Win (Rinn, 2003) под бинокулярным микроскопом STEMI 2000-C. Перекрестная датировка рядов TRW производилась при помощи кросс-корреляционного анализа, выполняемого с помощью программ TSAP Win (визуальным сравнением наложенных графиков хронологий и индивидуальных рядов измерений) и COFECHA (Holmes, 1983; Grissino-Mayer, 2001). Получены индивидуальные и локальные стандартизованные хронологии. Поскольку в рядах изменчивости абсолютных величин прироста деревьев содержатся и неклиматические сигналы (например, возрастные изменения, конкурентные взаимоотношения, воздействие экологически значимых событий и пр.), то для выделения климатического отклика разработана специальная методика (Fritts, 1976) индексирования измерений (Cook, 1985; Ваганов и др., 1996). Процедура стандартизации состоит из трех стадий: подбор индивидуальной аппроксимирующей кривой к ряду измеренных значений параметра годичных колец, получение индивидуальной индексированной серии и получение обобщенной (локальной) индексированной хронологии (Briffa et al., 1986). В данном исследовании для описания длительных трендов использовали разные методы: 67% кубический сглаживающий сплайн, экспоненциальные и/или линейные функции. В итоге выбирали тот или те методы стандартизации, который в максимальной степени сохраняет дендроклиматические взаимосвязи, в том числе долгосрочные. Обобщенные хронологии для участков получали усреднением биномиально взвешенной средней. Процедура стандартизации выполнялась с помощью программы ARSTAN (Cook and Krusic, 2005). Кроме стандартных хронологий, также путем удаления автокорреляционной компоненты из индивидуальных стандартный индексированных рядов и усреднения по участку были получены остаточные хронологии прироста. Для проведения дендроклиматического анализа были использованы следующие исходные данные по средней температуре воздуха и количеству осадков: ежемесячные ряды пространственно распределенного поля, суточные ряды пространственно распределенного поля и ежемесячные и суточные ряды метеостанций. На основе суточных данных рассчитывали скользящие ряды с шириной внутрисезонного окна 21 день и шагом 1 день. Для сезонных интервалов различной длительности также рассчитывали средние температуры и суммы осадков, суммы активных температур (суммы всех среднесуточных температур, превышающих заранее заданный порог, например, 0, 5 или 10 °С, за вычетом этого же порогового значения). Климатический отклик выражали парными коэффициентами корреляции Пирсона между хронологиями параметров годичных колец и климатическими рядами, уровень значимости корреляций определяли с помощью t-теста Стьюдента. При определении сезонности воздействия климатических факторов на прирост кедра с суточным разрешением начало и окончание воздействия примерно определяли по корреляциям TRW с 21-дневными скользящими рядами, затем рассчитывали сезонные ряды для этого интервала и сдвигали границы посуточно так, чтобы перебором найти максимум коэффициента дендроклиматической корреляции. Это позволяет выявить даже относительно слабый климатический отклик. Помимо использования хронологий и климатических переменных «как есть», проводили их разделение на низко- и высокочастотные компоненты применением сглаживающего фильтра (скользящая средняя с шириной окна 5-11 лет) и вычитанием сглаженной кривой из исходного ряда соответственно. Для анализа временной стабильности климатического отклика использовали графики скользящих коэффициентов корреляции с окном 30-40 лет и шагом 1 год. Для анализа пространственной стабильности отклика использовали классификацию хронологий TRW методом иерархического кластерного анализа, где в качестве входных характеристик используются коэффициенты корреляции TRW с сезонными климатическими факторами, даты начала и окончания воздействия этих сезонных факторов. Для выявления наиболее стрессовых для прироста кедра климатических факторов и событий для периода покрытия климатических рядов находили реперные годы (годы с максимумами и минимумами индексов TRW) и анализировали отклонения погодных условий этих лет от среднемноголетней климатической характеристики. Для проведения геномных исследований коллективом была выделена ДНК из хвои сосны кедровой сибирской и отработана методика приготовления библиотек методом ddRADseq. Проведено массовое секвенирование полученных библиотек с использованием платформы NovaSeq 6000 Illimina на 4-х дорожках с обеих (парных) сторон, длина прочтений 2 х 150 п.о. В настоящее время начался этап первичной биоинформатической обработки, включающий разработку и внедрение пайплайнов для биоинформатический обработки результатов секвенирования.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Получен массив количественных фенотипических характеристик индивидуальных деревьев P. sibirica, связанных с его первичным (длина хвои) и вторичным приростом (статистические характеристики TRW), а также с реакцией индивидуальных рядов радиального прироста на климатические экстремумы (коэффициенты сопротивления, восстановления и устойчивости) и колебания в целом (парные коэффициенты корреляции с сезонными температурами и осадками). Определены сроки начала и окончания максимально выраженного климатического отклика в приросте P. sibirica за весь период инструментальных климатических наблюдений 1900-2010 гг. и за два подпериода 1936-1973 и 1974-2010 гг. Полученные даты начала и окончания однонаправленного климатического отклика предположительно связаны со следующими фенологическими событиями: 1) активизацией фотосинтетической активности / началом первичного роста побегов весной, 2) началом камбиальной активности, 3) окончанием первичного роста побегов 4) окончанием камбиальной активности, 5) окончанием вторичного роста / снижением фотосинтетической активности при переходе деревьев в спячку осенью. Приготовлены и отсеквенированы библиотеки ddRADseq для 120 образцов ДНК сосны сибирской кедровой по модифицированной версии протокола, ранее отработанного нами для лиственницы сибирской. Для фрагментации ДНК обрабатывалась рестрикционными ферментами EcoRI и MseI, к образовавшимся фрагментам затем присоединяли адаптеры, содержащие уникальные для каждого образца нуклеотидные последовательности. После нескольких этапов очистки и ПЦР-амплификации полученные ДНК-библиотеки объединяли по 30 образцов для последующего секвенирования, и отбирали только фрагменты длиной 300-700 п.н. путем вырезания из агарозного геля после электрофореза. После проведения качественного фрагментного анализа всех 4 пулов ДНК-библиотек, а также контроля качества и оценки количества ДНК, библиотеки были секвенированы на приборе NovaSeq 6000, с длиной парноконцевых прочтений - 150 н.о. с одной стороны. По результатам удалось получить 6,8 млрд. прочтений, что согласуется с показателями секвенирования, проведенного ранее для первой части образцов (7,1 млрд.) и свидетельствует об однородности качества и количества прочтений двух независимых запусков Novaseq 600 (в 2022 и 2023 году) по всем образцам. Далее первичные данные прошли несколько этапов начальной обработки. Исходные чтения были отфильтрованы и обрезаны по показателям качества, а технические последовательности удалены. Разделение полученных данных по индивидуальным образцам проводилось на основе уникальных последовательностей адаптеров. Средняя длина прочтения по всем образцам после обработки составила 141 н.о. Отфильтрованные прочтения выравнивали на черновую сборку генома сосны сибирской. В среднем по 218 деревьям показатель выравнивания прочтений на геном равнялся 68,70%. На этом этапе 9 деревьев были полностью исключены из дальнейшего анализа из-за недостаточного количества прочтений и уровня картирования на референсный геном. Для поиска однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП, SNP) с помощью данных о выравнивании на участки генома сосны сибирской было построено 19,2 млн локусов, включающих 1813,1 млн прямых прочтений и 488,9 млн совпадающих парных концевых прочтений. Эффективное покрытие прочтениями в среднем на образец составило 5,3х, а среднее количество нуклеотидов на локус 125,5 н.о. Полученный набор из локусов, покрытых выравниванием, подвергся нескольким этапам фильтрации, чтобы оставить только те локусы, которые были найдены во всех выборках, содержатся по крайней мере в 85% образцов в целом и в 80% образцов в каждой выборке. Были отобраны только те SNP, максимально допустимый уровень наблюдаемой гетерозиготности для которых не превышал 0,85, а минимальная частота минорного аллеля была не менее 0,1. Заданные параметры фильтрации успешно прошли 209930 локусов (1,1% от общего количества). В 26000 из этих локусов были обнаружены 52368 биаллельных однонуклеоидных полиморфизмов, удовлетворяющих условиям поиска, из них 32985 транзиций и 19383 трансверсий в соотношении 1,7. Для каждой из 5 популяционных выборок рассчитывали следующие популяционно-генетические параметры: нуклеотидное разнообразие (π), наблюдаемая (Ho) и ожидаемая (He) гетерозиготность, индекс фиксации (FIS). Наибольшие значения наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности были получены в популяции ER (Ергаки – оз. Уютное, Радужное) и равнялись 0,309 и 0,312, наибольшее значение индекса фиксации в популяции RG (Саяно-Шушенский заповедник – р. Малая Голая), составило 0,086. Для выявления структуры популяции был проведен анализ главных компонент (PCA) и дискриминантный анализ главных компонент (DAPC). Выявлено, что исследуемые популяции не образуют ярко выраженных однозначных кластеров на основе PCA, но выделяются кластеры ER и SP на основе DAPC. Кроме того, структура популяции изучалась с помощью алгоритма Admixture, который оценивает максимальную вероятность предполагаемых генетических кластеров на основе генотипических данных. По полученным результатам видно, что структура популяции слабо выражена и деревья, принадлежащие разным географическим популяциям, не обосабливаются в отдельные кластеры. Был выполнен иерархический анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) и расчет попарных коэффициентов FST. Для анализа выборки были разделены на три группы: Саянский перевал (выборка SP), Саяно-Шушенский заповедник (выборки RG и RS) и Ергаки (выборки ER и TK). Анализ показал, что большая часть вариации сосредоточена внутри популяций (99,5%). Значения попарных коэффициентов FST оказались достаточно низкими (0,0037–0,0066), но значимыми на основе всех 52368 SNP. Географически ограниченное распространение может формировать генетическую структуру популяции и приводить к корреляции между генетической и географической дистанцией, называемой изоляцией по расстоянию. Для обнаружения такой корреляции на полученных данных был проведен тест Мантеля, его результаты не выявили у изучаемых популяций достоверной связи между генетическим расстоянием и географическим расстоянием.