Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Благодаря развитию методов предсказаний функций генов на основании принципа их ко-локализации, в области исследования бактериальных систем противовирусной защиты в последние годы произошла революция. Были описаны десятки новых консервативных кластеров генов для которых экспериментально показана иммунная функция. Анализ микробного пангенома показывает что гены связанные с иммунной функцией представляют собой самую разнообразную и быстро эволюционирующую группу, при этом можно ожидать что на данный момент описана лишь незначительная часть настоящего разнообразия противо-вирусных систем. С другой стороны, наличие такого большого количества иммунных систем означает что в природных условиях практически каждый раунд взаимодействия вирус-хозяин происходит при наличии какой-либо из систем защиты. Это должно оказывать огромное "эволюционное давление" на развитие вирусов и можно ожидать, что вирусные анти-защитные гены также не менее распространены в природе, однако данная сторона взаимодействия вирус-хозяин на данный момент изучена намного слабее. В данном проекте мы предлагаем обратиться к методам функциональной метагеномики для поиска новых вариантов бактериальных систем защиты и вирусных анти-защитных белков. В отличие от биоифнорматических методов предсказания новых кластеров защитных генов, основанных на принципах ко-локализации, скрининг больших библиотек метагеномной ДНК на способность обеспечивать защиту от вирусной инфекции позволит обнаруживать гены с искомой функцией без привязки к их геномной локализации, что потенциально позволит находить новые варианты редких защитных систем или систем не проявляющих тенденции к формированию островков защиты. В ходе первого года реализации проекта была подготовлена методологическая база для дальнейшего проведения функционального скрининга метагенмоных библиотек. Были отработаны протоколы выделения метагеномной ДНК из различных типов природных образцов (морская вода, придонные отложения, микробиота кишечника морских беспозвоночных и человека, почвы). Для создания плазмидных библиотек метагеномной ДНК требуется как большое количество материала, так и его высокое качество (отсутствие нуклеазной или механической фрагментации, отсутствие ингибиторов ферментативных реакций, например, гуминовых кислот, которые часто со-выделяются с ДНК из образцов почвы). Систематическое сравнение различных вариантов разрушения клеток, коммерческих наборов для выделения ДНК и способов дополнительной очистки с последующим анализом препаратов ДНК по ряду параметров позволило разработать протокол на основе Qiagen PowerSoil Pro набора для получения максимально целостных фрагментов метагеномной ДНК с высокой концентрацией и низкой примесью эукариотической ДНК и ингибиторов ферментативных реакций. Для самого процесса клонирования фрагментов метагеномной ДНК был отработан протокол Mosaic Ends Tagmentation, суть которого заключается в том что тотальная метагеномная ДНК фрагментируется путем обработки гиперактивной транспозазой Tn5, что приводит к ковалентному встраиванию специфических адаптеров по концам фрагментов ДНК. Далее, адаптеры могут быть использованы для клонирования фрагментов в линеаризованный вектор методом Gibson Assembly, что повышает эффективность клонирования примерно в 10 раз, по сравнению со стандартными процедурами лигирования фрагментов метагеномной ДНК по тупым концам. Мы разработали протокол экспрессии и очистки Tn5, а также отработали этапы процедур тагментации контрольной ДНК, сборки библиотеки плазмид по методу Gibson Assembly, а также трансформации с достижением эффективности 10в7 клонов на микрограмм исходной ДНК. Данные результаты позволят перейти к получению библиотек плазмид с метагеномной ДНК из природных образцов на следующем этапе проекта. В рамках проекта были проведены работы по поиску новых активностей известных анти-рестрикционных белков, а также поиску новых классов вирусных анти-защитных белков. Была сконструирована коллекция, включающая 17 известных анти-защитных белков и проверено их действие на системы защиты R-M I типа EcoKI - R-M III типа EcoPI - BREX I типа и CRISPR-Cas I типа из E. coli. Установлен ряд новых активностей, в частности показано, что DarA белок фага P1 оказался способным к эффективному ингибированию BREX системы за счет связывания с АТФазой BrxC, ведется дальнейшее исследование его анти-BREX активности. На основе полученной коллекции будет проведен масштабный скрининг взаимодействия вирусных белков с разнообразными системам бактериального иммунитета, что позволит выявить более обширную сеть взаимодействий которые могут включать как ингибирование систем основанных на распознавании ДНК, так и одновременную активацию абортивных систем защиты, представляющих собой "вторую линию" иммунной обороны клетки, как в случае установленного cценария с белком Ocr, ингибирующим BREX и R-M I системы защиты, но активирующим абортивный иммунитет PARIS. На следующем этапе реализации проекта большее внимание будет уделено абортивным системам гомологичным PARIS - Old, Gabija и Druantia. Также работа с PARIS и Old системами позволила нам выявить принципиально новые классы потенциальных анти-защитных белков. Поскольку данные системы активируются при взаимодействии с вирусными ДНК-мимиками или ингибиторами RecBCD, селекция мутантов фагов, утративших чувствительность к PARIS и Old защите позволяет идентифицировать их белки триггеры. Так, было обнаружено 2 новых потенциальных ДНК-мимика фага Т5 - ORF094 и ORF103. Наконец, нам удалось обнаружить первый вариант анти-CRISPR белка, активный против IE CRISPR-Cas системы E. coli - белок AcrIE9.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Благодаря развитию методов предсказаний функций генов на основании принципа их ко-локализации, в области исследования бактериальных систем противовирусной защиты в последние годы произошла революция. Были описаны десятки новых консервативных кластеров генов для которых экспериментально показана иммунная функция. Анализ микробного пангенома показывает что гены связанные с иммунной функцией представляют собой самую разнообразную и быстро эволюционирующую группу, при этом можно ожидать что на данный момент описана лишь незначительная часть настоящего разнообразия противо-вирусных систем. С другой стороны, наличие такого большого количества иммунных систем означает что в природных условиях практически каждый раунд взаимодействия вирус-хозяин происходит при наличии какой-либо из систем защиты. Это должно оказывать огромное "эволюционное давление" на развитие вирусов и можно ожидать, что вирусные анти-защитные гены также не менее распространены в природе, однако данная сторона взаимодействия вирус-хозяин на данный момент изучена намного слабее. В данном проекте мы предлагаем обратиться к методам функциональной метагеномики для поиска новых вариантов бактериальных систем защиты и вирусных анти-защитных белков. В отличие от биоинформатических методов предсказания новых кластеров защитных генов, основанных на принципах ко-локализации, скрининг больших библиотек метагеномной ДНК на способность обеспечивать защиту от вирусной инфекции позволит обнаруживать гены с искомой функцией без привязки к их геномной локализации, что потенциально позволит находить новые варианты редких защитных систем или систем не проявляющих тенденции к формированию островков защиты. Нами были разработаны процедуры выделения интактной метагеномной ДНК и клонирования плазмидных библиотек, содержащие протяженные фрагменты метагеномной ДНК. Глубина покрытия полученных метагеномных библиотек составляла 5*10e7 колоний. Функциональность полученных библиотек была проверена путем отбора нескольких новых вариантов генов дигидрофолатредуктазы, обеспечивающих устойчивость к триметоприму. Анализ функциональной микробиомики для отбора генов бактериального антифагового иммунитета был проведен с помощью метода tab-селекции, который позволяет изолировать резистентные клоны, даже если они несут губительные для инфицированной клетки гены абортивной защиты. Этот метод был применен для идентификации генов, обеспечивающих устойчивость к инфекции фагом Lambda. Неожиданно для нас была определена некодирующая РНК самого фага Лямбда, которая комплементарна мРНК репликативного белка О и точке начала репликации фага. Мы показали, что экспрессия этой нкРНК обеспечивает защиту от фага Lambda по принципу РНК-интерференции за счет снижения стабильности мРНК гена О. Нам удалось определить принципы распознавания инфекции и токсического ответа, обеспечиваемые системой абортивного иммунитета PARIS. Ранее было показано, что эта система активируется антирестрикционным белком Ocr, имитирующим ДНК. Мы показали, что ABC-АТФаза AriA и нуклеаза TOPRIM AriB образуют стабильный комплекс. Крио-ЭМ структура комплекса PARIS была решена в сотрудничестве с группами доктора Блейка Виденхефта (Университет Монтаны) и доктора Дэвида Бикарда (Институт Пастера). AriA АТФаза отвечает за распознавание триггера, что приводит к диссоциации AriB и его активации. Активированный AriB ингибирует трансляцию посредством расщепления специфических тРНК хозяина (tRNA_Lys). Кроме того, мы обнаружили, что иммунная защита PARIS может быть преодолена фагом Т5, который кодирует нерасщепляемый аналог tNRA_Lys. Это дает ответ на давний вопрос о роли тРНК, кодируемых фагами, и демонстрирует их потенциальную анти защитную функцию.