Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 работа по гранту проводилась по следующим направлениям: •Синтез, фотофизические и биологические исследования поликатионных фотосенсибилизаторов на основе фталоцианинов, полученных с использованием реакции восстановительного аминирования; •Разработка подходов к получению несимметричных фталоцианинов, содержащих в структуре одновременно гидрофильные катионные заместители и гидрофобные фрагменты; •Изучение антибактериальных свойств, синтезированных в проекте фталоцианинов; •Поведение новых фотосенсибилизаторов на бислойных липидных мембранах; •Молекулярно-динамическое моделирование взаимодействия тетра-замещенных порфиринатов фосфора с липидной мембраной; •Разработка подходов к получению тетра-замещенных порфиринатов фосфора(V), выбранных по данным моделирования; •Разработка подходов и получение систем для внутриклеточного измерения температуры в субмикронном масштабе. Показано, что тетра и окта-катионные фталоцианины и их комплексы с магнием и цинком обладают флуоресценцией и способностью к генерации синглетного кислорода в ДМСО и частично, в водных средах. В результате детальных исследований было установлено, что тетракатионный альфа-замещенный фталоцианинат цинка, полученный в нашей работе, обладает большим сродством к липидным мембранам, что в совокупности с частичным сохранением флуоресценции в водном растворе и высоким квантовым выходом генерации синглетного кислорода (0.46 в ДМСО) делает его перспективным фотосенсибилизатором для фотодинамической терапии. Эти данные опубликованы в журнале Dyes and Pigments (Q1) (Bunin et al. Dyes and Pigments, 2022, https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2022.110768). Биологические испытания катионных фталоцианинатов цинка, демонстрирующих наибольшие квантовые выходы генерации синглетного кислорода (0.46–0.95 в ДМСО) на клеточных линиях MCF-7 и фибробластов показали высокую световую цитотоксичность (MTT-тест, IC50 < 100 nM) при низкой темновой цитотоксичности. Показано, что фталоцианинаты цинка связываются с бычьим сывороточным альбумином, что приводит к их мономеризации и способности флуоресцировать in vivo. Разработаны методы синтеза неизвестного ранее тетра-3,4,5,6-(диэтиламинометилфенокси)замещенного фталонитрила, из которого получен новый катионный тетра-замещенный несимметричный фталоцианинат цинка A3B-типа, а также гексадека-катионный фталоцианинат цинка. Последний отлично растворим в воде и присутствует там в виде мономерной формы. Для полученных соединений измерены фотофизические характеристики. Полученные результаты указывают на возможное применение гексадека-катионного фталоцианината цинка в качестве средства для флуоресцентной биовизуализации. Также, в данном отчетном периоде была продолжена работа по получению и исследованию свойств катионных фталоцианинов со стерически-затрудненными заместителями. Синтезированный в проекте тетра-2,6-диметил-арилокси- непериферийно-замещенный фталоцианинат цинка присутствует в водном растворе в мономерном виде, при этом квантовый выход генерации синглетного кислорода в ДМСО оказался равен 0.64, а квантовый выход флуоресценции — 0.24. Для октазамещенных катионных комплексов проведены исследования абсорбции на бислойных липидных мембранах (БЛМ) и фотодинамической активности. Значения абсорбции для всех исследованных соединений оказались близки. Фотодинамическая активность синтезированных соединений на БЛМ была изучена с использованием мишени для синглетного кислорода - di-4-ANEPPS. Показано, что скорость разрушения ловушки завит от концентрации фотосенсибилизатора, при этом наибольшую фотодинамическую активность проявил комплекс цинка. Изучена антимикробная активность синтезированных катионных фталоцианинов на штаммах бактерий A. Baumannii NIH601 и E. Coli T61. К сожалению, обнаружено, что количество клеток не меняется в зависимости от концентрации соединений и после освещения, что говорит об отсутствии антибактериального эффекта от данных соединений. Возможно, это обусловлено агрегацией данных соединений в растворе. Ранее на примере порфиринатов фосфора(V) нами было показано, что ориентация молекул фотосенсибилизаторов относительно мембраны влияет на эффективность генерации синглетного кислорода и их антибактериальную активность. Для детального проведения анализа взаимосвязи структура-функция для порфиринов фосфора с использованием методов квантовой химии и молекулярной динамики была построена библиотека возможных для синтеза соединений. Для 7-ми порфиринов, отличающихся природой заместителей в макрокольце были проведены молекулярно-динамические расчеты с помощью программного пакета GROMACS 2020 и силового поля CHARMM36. По результатам анализа методами молекулярной динамики и квантовой химии для проведения синтеза и дальнейших экспериментов рекомендованы 4-трет-бутилфенил и мезитил-порфиринаты фосфора(V), которые были синтезированы из соответствующих свободных оснований. Отдельно были отработаны методики выделения целевых порфиринатов фосфора в индивидуальном виде. На следующем этапе выполнения проекта планируется изучить их бактериальные свойства на примере грамотрицательных и грамположительных бактерий. На данном этапе проекта было показано, что порфиринаты фосфора(V) могут быть использованы для определения температуры живых клеток (CHO-K1 и HeLa) с точностью до 0.1oC. Параллельно был выявлен необычный факт, что при введении вещества в клетку оно дефосфорилируется при взаимодействии с белками с образованием биосовместимых фосфатов. Интересно, что использованные нами свободные порфирины не растворяются в воде и, таким образом, без фосфора не могут быть доставлены в клетку. Таким образом разработан удобный и простой метод гидрофилизации порфиринов за счет введения катиона фосфора(V) в макрокольцо. Данное исследование опубликовано в журнале Sensors and Actuators A. (https://doi.org/10.1016/j.sna.2022.113917). Также в этом году были завершены исследования фотодинамической эффективности и адсорбции на бислойных липидных мембранах дикатионных производных пиразинопорфирина, содержащих триэтиамонийные группы, включая комплексы никеля и цинка. Сравнивая данные пиразинопорфирины, с β-имидазол-замещенными порфиринами, изученными нами ранее было установлено, что связывание фотосенсибилизатора с клеточной мембраной может определяться их периферийными группами, а не только природой катиона-комплексообразователя. Однако этот тип связывания не изменяет скорость процесса окисления молекул-мишеней за счет генерации синглетного кислорода. Тем не менее, увеличение адсорбции приводит к более высокой поверхностной концентрации фотосенсибилизатора при одинаковом содержании этих молекул в растворе, что, возможно, обеспечивает более высокую эффективность этих молекул для PDT при данной объемной концентрации. Данные результаты опубликованы в журнале Membranes (https://doi.org/10.3390/membranes12090846).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В отчетном периоде проводились работы по направлениям, связанным с синтезом, изучением фотофизических свойств и фотодинамического поведения двух классов катионных фотосенсибилизаторов – (1) порфиринатов фосфора(V) и (2) кватернизованных производных аминометилфенокси-замещенных фталоцианинатов цинка. В рамках первого направления разработан общий метод получения новых катионных порфиринатов фосфора(V) с аксиальными этокси-группами, подразумевающий взаимодействие порфиринов с оптимизированным количеством POBr3 в кипящем пиридине с последующим взаимодействием промежуточно-образующегося дибромпроизводного с этанолом. Показана связь между природой заместителей в порфириновом кольце, реакционной способностью порфиринов в изученных реакциях, и фотофизическими свойствами синтезированных комплексов, в частности, фотостабильности и способности к генерации синглетного кислорода. Показано, что тетра-мезо-(4-метоксифенил)порфиринат диэтоксифосфора(V) обладает выраженной антимикробной фотодинамической активностью с минимальной ингибирующей концентрацией 25мкМ по отношению к E.coli. При этом MIC50 в случае штаммов бактерий T61 E.coli оказалась в 2 раза лучше, чем для ампициллина , а для штаммов A.Baumannii сопоставима с колицином. По результатам исследования антибактериальной активности порфиринатов фосфора(V) по отношению к E.coli и A.Baumannii опубликована статья Batishchev, O. V.; Kalutskii, M.A.; Varlamova, E.A.; Konstantinova, A.N.; Makrinsky, K.I.; Ermakov, Y.A.; Meshkov, I.N.; Sokolov, V.S.; Gorbunova, Y.G. Antimicrobial Activity of Photosensitizers: Arrangement in Bacterial Membrane Matters. Front. Mol. Biosci. 2023, 10, doi:10.3389/fmolb.2023.1192794. По результатам статьи опубликованы пресс-релизы со ссылкой на РНФ на сайтах ТАСС Наука (https://clck.ru/377Sr5), новостей РАН (https://clck.ru/377Sxp) и ИФХЭ РАН (https://clck.ru/377SzG). В рамках второго направления получены и исследованы новые представители тетра-, окта- и гексадека-замещенных фталоцианинов, содержащих кватернизованные аминометилфеноксильные группы, а также их производные, содержащие дополнительные алкильные группы в ароматических заместителях. Комплексный подход к изучению поведения полученных фталоцианинов в водных растворах позволил определить необходимые и достаточные количества катионных заместителей для подавления агрегации и увеличения квантовых выходов синглетного кислорода. Вместе с тем, показано, что агрегаты катионных фталоцианинов способны генерировать другие активные формы кислорода, а также при сорбции на бактериальных мембранах возможна мономеризация комплексов и активизация фотофизических процессов, типичных для их мономерных форм, в частности, разгорание люминесценции. Анализ литературных данных позволил обобщить мировой опыт по изучению агрегированных форм тетрапирролов в фотодинамической терапии и определить перспективы развития данного направления. По результатам данного анализа опубликована обзорная статья Bunin, D.A.; Martynov, A.G.; Gvozdev, D.A.; Gorbunova, Y.G. Phthalocyanine Aggregates in the Photodynamic Therapy: Dogmas, Controversies, and Future Prospects. Biophys. Rev. 2023, doi:10.1007/s12551-023-01129-7. Изучение взаимодействия катионных тетра- и окта-замещенных фталоцианинов и их комплексов с магнием и цинком с модельными липидными мембранами позволило определить влияние структурных факторов на глубину проникновения фотосенсибилизаторов в мембраны, а также показать, что именно сорбция на мембране определяет фотодинамическую активность комплексов. По результатам работы представлено восемь докладов на профильных конференциях. Задачи этапа выполнены в полном объеме.