Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В результате выполнения работ в отчетном периода были получены препараты белка Е коронавируса SARS-CoV-2 и проведена их структурная характеризация методом атомной силовой микроскопии. Было показано, что белок Е формирует в растворе кластеры различных размеров, минимальные из которых имели характерную высоту около 10 нм и латеральный диаметр около 25 нм. Из литературных данных известно, что белок Е коронавируса SARS-CoV-2 присутствует в его мембране в виде пентамеров, характерный размер которых согласуется с полученными методом АСМ размерами белковых кластеров. Так как белок Е имеет в своей структуре трансмембранный домен, то его агрегация в водной среде достаточно ожидаема. При этом мы установили, что при взаимодействии раствора белка с липидными мембранами крупные агрегаты белка исчезают, что, по-видимому, обусловлено его встраиванием в мембрану. В данном случае все белковые кластеры имеют одинаковый размер, соответствующий размеру пентамеров белка. Таким образом, структурные исследования методом АСМ показали, что полученный нами белок Е встраивается в липидный бислой, формируя пентамеры, что характерно для нативного белка Е коронавируса SARS-CoV-2. Известно, что пентамеры белка Е должны играть роль виропоринов, формируя ионные каналы в мембране коронавируса. Поэтому нами были проведены исследования образования таких каналов при встраивании белка Е в гигантские однослойные везикулы. Было установлено, белок Е способен не только формировать поры в липидных мембранах, но и деформировать везикулы, образуя двумембранные везикулы. Для подробного изучения данного процесса мы провели исследования на гигантских однослойных липосомах, флуоресцентно меченых по липидной компоненте. В результате было показано, что при добавлении белка Е в концентрации 1000 нМ однослойная везикула переходит в двойную после сильной промежуточной деформации. Для более детальной оценки физико-химического механизма влияния белка Е на деформации липидного бислоя были проведены эксперименты на липидных нанотрубках. Мы показали, что белок Е может адсорбироваться на бислое с положительной кривизной и уменьшать радиус липидных нанотрубок. Для исследования процесса формирования пор белком Е коронавируса SARS-CoV-2 были проведены эксперименты с помощью метода пэтч-кламп. Рост проводимости мембран наблюдался для концентрациий белка Е от 300 нМ. При увеличении концентрации белка до 1000 нМ наблюдаются ступенчатые мульти-сигналы значительно большей длительности, с аналогичным изменением амплитуды тока через мембрану. Наблюдаемые мульти-сигналы демонстрируют, что при высоких концентрациях белок Е, вероятно, формирует поры более сложной структуры, состоящие из белковых и липидных молекул, тогда как при более низких концентрациях ступенчатые и спайк сигналы могут соответствовать формированию пор меньшего радиуса. В рамках блока исследований методами молекулярной динамики и молекулярного докинга структуры белка S данного вируса нашей целью было определить сайты связывания, особенно скрытые сайты связывания в рецептор-связывающем домене (RBD) белка S. Для анализа мы использовали наш недавно разработанный подход глубокого обучения под названием BiteNet для пространственно-временной идентификации сайтов связывания в белковых структурах. В результате были выбраны 3 лучших сайта связывания. Для подбора возможных кандидатов в лекарственные молекулы, взаимодействующие с обнаруженными сайтами связывания, мы рассмотрели одобренные FDA малые молекулы, а также исследуемые препараты из библиотеки DrugBank (https://www.drugbank.ca/). Мы наблюдали относительно хорошие показатели молекулярного докинга (показатель ICM < -30,0) для некоторых соединений, что указывает на то, что выбранные конформации и сайты связывания являются многообещающими для крупномасштабного поиска лекарственных кандидатов, запланированного на второй год проекта. В рамках подготовки к работам следующего этапа выполнения проекта были проведены эксперименты по исследованию взаимодействия пептида слияния белка слияния вируса гриппа с бислойными липидными мембранами гигантских однослойных везикул (ГОВ). На основе данных эксперимента и молекулярной динамики была разработана теоретическая модель влияния пептида слияния на структуру мембран. Было показано, что образование пептидного кластера энергетически выгодно при превышении некоторой пороговой поверхностной концентрации пептида слияния. Рассчитанная величина пороговой концентрации оказалась в количественном согласии с концентрацией пептида, при которой наблюдалась кластеризация при молекулярном моделировании. Близкая поверхностная концентрация пептидов слияния достигается при их встраивании в мембрану-мишень при вирусном инфицировании. В рамках разработанной упругой модели было показано, что в центре пептидного кластера значительно облегчается образование сквозной поры. Таким образом, весьма вероятно, что опосредованное белком слияния слияние мембран при вирусном инфицировании должно сопровождаться утечкой, т.е., образованием пор в мембране-мишени. Мембрана на кромке сильно деформирована, что способствует образованию сайтов слияния непосредственно вблизи пор, поскольку это позволяет частично релаксировать упругие напряжения. С целью построения физической модели процесса формирования двумембранных везикул, играющих ключевую роль в процессе формирования дочерних вирионов в инфицированной клетке, мы рассматривали модель сферической везикулы, в которой возможен фазовый переход с образованием жидко-упорядоченной (рафтовой) и жидко-неупорядоченной липидных фракций. Аналитические показано, что в присутствии пор в мембране исходной везикулы, ассоциированных, например, в пентамерами белка Е, за счет фазового разделения по липидной компоненте в таких везикулах возможна их трансформация в двумембранные везикулы Были определены параметры системы, при которых возможно спонтанное образование двумембранных везикул, а также показано, что для характерных для липидного бислоя величинах модулей упругой деформации размер таких везикул будет составлять примерно 220 нм, что хорошо согласуется с имеющимися экспериментальными данными по кроиэлектронной томографии. Кроме того, мы показали, что еще одним способом добиться создания двумембранных везикул может быть использование специфических белков: пептиды в липидном бислое, перераспределяясь, могут существенно влиять на величину граничной энергии жидко-упорядоченных липидных доменов, а также менять свойства макроскопических фаз (например, меняя модуль изгиба B или создавать несимметричную по монослоям спонтанную кривизну); помимо этого, энергии нескольких АТФ в принципе достаточно для преодоления энергетических барьеров на деление везикулы.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе выполнения проекта нами были проведены работы по изучению физико-химических механизмов формирования пор белком Е коронавируса SARS-CoV-2. Для этого мы применили комбинацию двух методов – метода пэтч-кламп, позволяющего исследовать электрическую проводимость мембран в присутствии белка Е, с методом сканирующей лазерной конфокальной микроскопии на модели гигантских однослойных везикул. Было показано, что адсорбция белка Е приводит к утечке водорастворимого флуоресцентного красителя кальцеина из везикул, а также к деформациям мембраны везикулы. При этом как скорость утечки, так и степень отклонения формы везикулы от сферической пороговым образом изменялась при наличии в составе мембраны 40 мольных % холестерина. Эти результаты согласуются с полученными ранее структурными данными, говорящими о том, что наличие в мембране холестерина стабилизирует пентамерные каналы белка Е коронавируса SARS-CoV-2. В этом же случае мы наблюдали значительные деформации формы мембран везикул, что может говорить о возможности формирования двумембранных везикул в данных условиях за счет дополнительных возмущений структуры мембраны. Действительно, наличие в мембране везикулы сильно проводящих дефектов позволяет ей быстро сбрасывать внутренний водный объем, что упрощает проникновение части мембраны внутрь везикул и образование двумембранных везикул. Тем не менее, даже в отсутствии холестерина мы наблюдали утечку кальцеина из везикул, происходящую за значительно большее время. Это говорит о том, что даже в таких условиях белок Е коронавируса SARS-CoV-2 способен формировать поры в мембранах везикул, но по какому-то другому механизму. Для детального исследования такого механизма нами были проведены эксперименты по изучение проводимости мембраны методом пэтч-кламп. При добавлении к мембране белка Е коронавируса SARS-CoV-2 мы наблюдали появление кратковременных скачков проводимости. Таким образом, в данном случае белок Е коронавируса SARS-CoV-2 ведет себя как амфипатичесий пептид, для которых основным типом проводимости являются как раз короткоживущие дефекты, соответствующие переходам пептидов через липидных поры в мембране. В принципе, формирование таких пор возможно за счет примембранного участка белка Е, представляющего собой достаточно протяженный амфипатический пептид. Эти результаты согласуются с измерениями утечки гигантских однослойных везикул: размер формируемых пор достаточен для выхода небольших молекул кальцеина, в то время как короткое время жизни образующихся дефектов не позволяет кальцеину быстро выйти из везикулы. При этом отсутствие других типов проводимости говорит о невозможности белка Е сформировать какие-либо устойчивые каналы для данного липидного состава. Для липидного состава, содержащего 30 мольных % холестерина, мы зарегистрировали появление небольшого количества ступенек проводимости, а также многоуровневых сигналов, что говорит о возможности кооперативного взаимодействия молекул белка Е в данных условиях. Тем не менее, эти события были достаточно кратковременными, что также не позволяет быстро высвободить кальцеин из везикул в аналогичных условиях. И только для 40 мольных % холестерина мы наблюдали ступеньки проводимости, стабильные в течение нескольких минут. Однако, амплитуда тока в этом случае была ниже, чем для одиночных кратковременных событий. Это говорит о том, что стабильные каналы, формируемые белком Е, отличаются от случая кооперативной транслокации нескольких пептидов. Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что бля белка Е характерно несколько типов мембранной активности. В отсутствии холестерина он формирует небольшие липидные поры в мембране за счет своей амфипатической примембранной части. Такие поры являются короткоживущими, но достаточно большими по радиусу, что, возможно, говорит о транслокации через них амфипатических участков белка Е. В присутствии же в мембране 40 мольных % холестерина стабилизирует пентамерный канал, сформированный уже трансмембранными фрагментами белка. Сочетание этих факторов: возможности формировать стабильные каналы и возможности влиять на структуру мембраны за счет амфипатического примембранного участка говорит о том, что данный белок может выполнять как роль виропорина, так и участвовать в деформациях мембраны при формировании двумембранных везикул в эндоплазматическом ретикулуме. Нами были продолжены работы по скринингу виртуальных лигандов (VLS) против наиболее перспективных обнаруженных сайтов связывания в выбранных мишенях белка с использованием химической библиотеки одобренных лекарств или молекул, подобных молекулам лекарственных препаратов, которые находятся в клинических испытаниях, полученные из ресурса DrugBank. В 2023 году поиск биоактивных соединений происходил для неструктурных белков (NSP) коронавируса SARS-CoV-2. Для каждой мишени мы получили ранжированный список из примерно 1 млн. химических соединений библиотеки REAL Enamine, из которой отобрали наиболее перспективные соединения для дальнейшего химического синтеза. С помощью метода пэтч-кламп нам удалось обнаружить способность пептида слияния белка S коронавируса SARS-CoV-2 формировать поры в липидной мембране. Оказалось, что пептид слияния белка S коронавируса SARS-CoV-2 способен адсорбироваться и формировать поры даже в незаряженных мембранах, в отличие от антимикробных амфипатических пептидов, взаимодействие которых с мембраной требует наличия отрицательно заряженных липидов. Неожиданным открытием было то, что добавление в объем раствора в 10 раз меньшей концентрации пептида слияния приводит к блокировке образования подобных проводящих структур. Вообще говоря, для антимикробных пептидов ранее было показано, что предварительная адсорбция пептидов препятствует дальнейшему образованию пор. Однако, насколько нам известно, никто не демонстрировал подобного эффекта для пептидов слияния каких-либо вирусов. Поэтому обнаруженная нами возможность блокировки мембранной активности пептидов слияния белка S коронавируса SARS-CoV-2 с помощью низких концентраций самого же пептида может стать основой для разработки противовирусных лекарственных препаратов. Для детального изучения физико-химических механизмов активности пептида слияния и белков слияния коронавируса SARS-CoV-2 в целом с помощью феноменологии теории упругости жидких кристаллов, адаптированной к липидным мембранам, нами были рассмотрены начальные стадии слияния коронавируса SARS-CoV-2 с липидными мембранами. Мы рассмотрели самую раннюю стадию слияния вирусов, и, в рамках теории упругости жидких кристаллов, адаптированной к липидным мембранам, показали, что мембранные деформации, вызванные встраиванием в нее амфипатических пептидов слияния, опосредуют латеральное взаимодействие этих пептидов и заставляют их кооперативно собираться в симметричную структуру. Это согласуется с экспериментальными данными по изучению проводимости мембран в присутствии пептидов слияния белка S коронавируса SARS-CoV-2 методом пэтч-кламп, которые показали наличие долгоживущих проводящих каналов, сформированных за счет кооперативного встраивания пептидов слияния. Однако, при структурных перестройках эктодоменов белка S коронавируса SARS-CoV-2 в процессе вирус-индуцированного слияния мембран, встраивание такой кооперативной структуры придает дополнительный крутящий момент, который деформирует мембрану и дополнительно стабилизирует симметричную розетку слияния, тем самым позволяя уменьшить количество пептидов, необходимых для слияния. По результатам нашей работы мы пришли к выводу, что прямая механическая активность белков слияния должна более надежно способствовать слиянию мембран по сравнению с локальной модификацией упругих свойств целевой мембраны встроенными пептидами слияния. Эта активность может быть результатом согласованного действия различных субъединиц белков слияния и клеточных рецептором, с которыми они взаимодействуют, что и реализуется в случае коронавируса SARS-CoV-2.