КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 22-13-00212
НазваниеНовые аналоги нуклеиновых кислот для лечения инфекций, вызванных лекарственно-устойчивыми штаммами патогенных бактерий
РуководительСтеценко Дмитрий Александрович, Кандидат химических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук", Новосибирская обл
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2022 г. - 2024 г. |
Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-103 - Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности
Ключевые словаAнтисмысловые олигонуклеотиды, конъюгаты векторных пептидов, нозокомиальные инфекции, посттранскрипционное ингибирование экспрессии генов, антибиотикоустойчивость, доставка в клетки
Код ГРНТИ31.23.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
В докладе ВОЗ, опубликованном в апреле 2014 года, распространение лекарственной устойчивости патогенных микроорганизмов обозначено как «одна из серьезнейших угроз для здоровья людей», которая требует для своего решения объединенных усилий ученых развитых стран мира. Производные нуклеиновых кислот, способные избирательно подавлять экспрессию отдельно взятых генов, рассматриваются за рубежом в качестве перспективных инструментов для преодоления бактериальной антибиотикоустойчивости. В то же время в Российской Федерации, в отличие от ведущих зарубежных стран, этой теме все еще уделяется недостаточно внимания. Широкое распространение в последнее время нозокомиальных (госпитальных) инфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами Enterococcus faecius, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter sp. (патогены группы «ESKAPE»), делает разработку новых эффективных средств борьбы с ними особенно актуальной. Однако для успешного противодействия бактериальным инфекциям с помощью производных нуклеиновых кислот необходимо в первую очередь обеспечить эффективную доставку препаратов в клетки бактерий.
Данный проект нацелен на разработку новых производных антисмысловых олигонуклеотидов с улучшенным проникновением в клетки бактерий Staphylococcus aureus и Acinetobacter baumannii, входящих в группу «ESKAPE», на основе опыта научной группы в получении аналогов нуклеиновых кислот и в создании систем доставки олигонуклеотидов в клетки. Результаты реализации проекта предназначены для использования при лечении нозокомиальных (внутрибольничных) инфекций, вызываемых антибиотикорезистентными штаммами патогенных бактерий Acinetobacter baumannii и Staphylococcus aureus (MRSA), которые по классификации ВОЗ относятся к критически высокому и высокому уровню приоритетности, соответственно. Таким образом, тематика проекта имеет высокую значимость и заполняет имеющийся в отечественной фундаментальной науке пробел в области разработки антибактериальных препаратов на основе производных нуклеиновых кислот.
Ожидаемые результаты
Результаты реализации проекта предназначены для использования в медицине, а именно, при лечении нозокомиальных (внутрибольничных) инфекций, вызываемых антибиотикорезистентными штаммами бактериальных патогенов Acinetobacter baumannii и Staphylococcus aureus (MRSA), которые по классификации ВОЗ относятся к критически высокому и высокому уровню приоритетности, соответственно.
При успешном решении всех поставленных задач проекта мы планируем достичь следующих конкретных результатов.
1. Будет проведен детальный анализ научно-технической литературы по использованию производных олигонуклеотидов в качестве антибактериальных средств, современным методам преодоления антибиотикорезистентности и лечения инфекций, вызываемых лекарственно-устойчивыми штаммами бактериальных патогенов, и механизмам развития лекарственной устойчивости у бактерий.
2. С помощью компьютерного моделирования вторичной структуры мРНК будут определены последовательности антисмысловых олигонуклеотидов, обеспечивающих наилучшее связывание in vitro с мРНК генов rpoD и trmD A. baumannii, и гена mecA1 S. aureus (MRSA).
3. Будут разработаны и оптимизированы методики химического синтеза антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на ингибирование экспрессии выбранных бактериальных генов, и получены экспериментальные образцы олигонуклеотидов, в том числе синтезированных впервые.
4. Будут подобраны эффективные методики доставки двух основных типов исследуемых аналогов олигонуклеотидов в клетки A. baumannii и S. aureus (MRSA).
5. Будут проведены микробиологические эксперименты по изучению воздействия антисмысловых олигонуклеотидов, в том числе впервые полученных, на рост культур указанных патогенов в условиях, имитирующих условия внутри организма, и определены последовательности, типы и комбинации олигонуклеотидов, обеспечивающие наибольший эффект in vitro; определен индекс селективности препаратов.
6. Будут проведены эксперименты in vivo на лабораторных крысах (модель абсцесса) по определению скорости заживления раны при воздействии наиболее активных in vitro соединений и идентифицированы кандидаты для проведения доклинических испытаний.
7. Будет обобщена информация, полученная в рамках проекта, по определению перспективных направлений исследований по разработке технологии преодоления антибиотикорезистентности.
В силу особой важности превентивной разработки методов эффективного терапевтического воздействия на антибиотикорезистентные штаммы бактерий, в том числе таких, которые будут способны обеспечивать гибкое реагирование на возникающие эпидемиологические угрозы, использование новых производных олигонуклеотидов для создания перспективных антибактериальных препаратов способно сыграть существенную положительную роль в интересах укрепления эпидемиологической безопасности Российской Федерации.
При отсутствии действенных антибиотиков или низкомолекулярных антибактериальных препаратов в отношении некоторых особо устойчивых патогенов, таких как A. baumannii, и S. aureus (MRSA), и прогнозируемого возникновения новых видов устойчивости круг возможных альтернатив для антибактериальной терапии сужается. В то же время терапевтические олигонуклеотиды могут быть относительно легко перенастроены на новую биологическую мишень, что потребует меньших затрат, чем разработка de novo препарата на основе малой молекулы.
Основной проблемой, успешное решение которой позволит широко внедрить терапевтические олигонуклеотиды в медицинскую практику, является недостаточное проникновение в клетки, что влечет за собой низкую биодоступность и неудачную фармакокинетику для большинства известных производных олигонуклеотидов. От успешного конкретного решения этой проблемы, а именно, обеспечения эффективной доставки аналогов олигонуклеотидов в клетки бактерий, будет зависеть успех данного проекта.
В результате успешного выполнения проекта заявители прогнозируют возрастание степени готовности органов здравоохранения государства к борьбе с распространением нозокомиальных (внутрибольничных) бактериальных инфекций, вызываемых антибиотикорезистентными штаммами A. baumannii и S. aureus (MRSA), что может привести к экономии бюджетных средств на лечение инфекционных больных за счет внедрения эффективных технологий преодоления как уже существующей, так и способной возникнуть в будущем устойчивости к традиционным и перспективным антибиотикам. В среднесрочной перспективе развитие технологии антибактериальных олигонуклеотидов в отношении наиболее опасных бактерий будет способствовать парированию угрозы биотерроризма и применения биологического оружия.
Заявители считают, что разработка терапевтических аналогов олигонуклеотидов может привести не только к решению проблемы преодоления антибиотикорезистентности бактериальных возбудителей социально-значимых заболеваний с множественной лекарственной устойчивостью, но и к созданию препаратов против опасных вирусных инфекций, таких как коронавирусная инфекция (COVID-19), грипп птиц, японский и клещевой энцефалит, и протозойных инфекций, таких как малярия. Таким образом, данный проект может послужить основой для возникновения нового для России класса лекарственных препаратов.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За отчетный период был проделан обзор литературы по использованию антисмысловых олигонуклеотидов (АОН) для преодоления антибиотикорезистентности бактериальных патогенов с включением более 40 новых публикаций за период 2017-2022 гг. В связи с появлением за последние три года целого ряда информативных обзоров по данной тематике (например, Wojciechowska, 2020; Chen, 2021; Jani, 2021; Nezhadi, 2022; Bardouni, 2022), было принято решение отложить направление обзора в научный журнал до получения значимых результатов с новыми АОН, разрабатываемыми в рамках данного проекта, с целью включения полученных данных в обзор и сравнения с уже известными соединениями.
Критический анализ исходного набора генов-мишеней в свете появившихся в последнее время публикаций, в особенности, по воздействию АОН на антибиотикорезистентные штаммы A. baumannii, привел смещению фокуса проекта на более перспективные с точки зрения потенциального терапевтического применения гены «домашнего хозяйства» gyrA (Altman, 2021), acpP и ftsZ (Nejad, 2021), и ген устойчивости к аминогликозидным антибиотикам aac(6′)-Ib (Lopez, 2015), тогда как для S. aureus (MRSA) основной мишенью по-прежнему выступает ген устойчивости к бета-лактамным антибиотикам mecA1. Был проведен скрининг имеющихся в коллекции штаммов А. baumannii, в том числе нескольких клинических изолятов, показывающих множественную лекарственную устойчивость (MDR и XDR), на наличие мутаций в районе участков связывания АОН в мРНК генов gyrA и aac(6′)-Ib. Это позволило внести коррективы в подобранные последовательности АОН, нацеленных на ген gyrA, и выбрать соответствующие штаммы для последующих микробиологических экспериментов.
В отчетном году проекта были получены фосфорилгуанидиновые (2′-ОМе ФГО) и мезилфосфорамидные (μ-ОDN) антисмысловые олигонуклеотиды (АОН), нацеленные на подавление экспрессии гена rpoD A. baumannii и S. aureus (MRSA). При получении набора АОН были использованы оптимизированные ранее оригинальные методики. Структура всех полученных олигонуклеотидов была подтверждена с помощью масс-спектрометрии ESI MS или MALDI-TOF. Данные олигонуклеотиды будут использованы на последующем этапе проекта для сравнения с олигонуклеотидами, нацеленными на гены gyrA и aac(6′)-Ib A. baumannii и новыми цвиттер-ионными производными.
Был получен набор векторных пептидов для облегчения доставки антисмысловых олигонуклеотидов через клеточную стенку бактерий. При синтезе указанных пептидов по Fmoc-схеме был использован оригинальный полимерный носитель JeffaGel, разработанный ранее для данного проекта. Финальное отщепление пептида от полимера и деблокирование защитных групп боковых цепей нескольких остатков аргинина было проведено по разработанной ранее оригинальной методике с использованием полифторированного спирта.
Основной фундаментальной задачей первого года проекта, которая была успешно выполнена (Патрушев, 2023), стала разработка методик синтеза и получение новых цвиттер-ионных олигонуклеотидов с сульфонилфосфорамидными группами. В основе концепции получения данных цвиттер-ионных олигонуклеотидов была положена идея создания функциональных аналогов олигонуклеотид-пептидных конъюгатов, которые зарекомендовали себя как лучшие на сегодняшний день антибактериальные антисмысловые агенты. При этом олигонуклеотидная часть конъюгатов, в основном, представлена фосфордиамидным морфолиновым олигомером (ФМО) или пептидно-нуклеиновой кислотой (ПНК), а пептидная часть – векторным пептидом, как правило, включающим остатки оснóвных аминокислот: аргинина, лизина или гистидина. Мы предположили, что катионные группы, имитирующие остатки оснóвных аминокислот, могут быть введены непосредственно в состав олигонуклеотида, например, по межнуклеотидным положениям с заменой природных фосфатных групп цвиттер-ионными, например, сульфонилфосфорамидными группами с катионными боковыми цепями.
На начальном этапе по разработанной методике из коммерчески доступного предшественника были впервые получены 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-сульфонилфосфорамидные (THIQ, или θ) производные олигонуклеотидов, подтверждена их структура и показан цвиттер-ионный характер, т.е. протонирование вторичной аминогруппы (рКа ~10,5) в водных средах при значениях рН, близких физиологическому. Синтезированные θ-олигонуклеотиды смешанной последовательности с несколькими THIQ-группами продемонстрировали неплохое для объемной бициклической модификации комплементарное связывание с ДНК и РНК. Результаты данной работы выходят в печати в начале следующего года (Патрушев, 2023).
Далее была разработана оригинальная методика получения новых цвиттерионных (4-аминометил)-бензолсульфонилфосфорамидных производных олигонуклеотидов с использованием алифатической азидогруппы в качестве замаскированной аминогруппы с двойной реакцией Штаудингера на твердой фазе. Полученные олигонуклеотиды с аминометильными группами (pKa ~10), близкие по оснóвности к остаткам лизина, были далее успешно конвертированы в соответствующие новые цвиттер-ионные гуанидиновые производные с оснóвностью, соответствующей остаткам аргинина (рКа ~13). Гуанидиновые цвиттер-ионные производные представляются наиболее перспективными при изучении антибактериальной активности по аналогии с конъюгатами векторных пептидов, богатых остатками аргинина, например, (RFF)3RXB и (RXR)4XB. По итогам работы в отчетном году намечено подать заявку на патент РФ в начале 2023 года.
Публикации
1. Патрушев Д.Э., Буракова Е.А., Бизяев С.Н., Фокина А.А., Стеценко Д.А. Новые цвиттер-ионные олигонуклеотиды: получение и комплементарное связывание. Молекулярная биология, 2023, Т. 57, №2, стр. 1-18 (год публикации - 2023)
Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В экспериментах по подавлению экспрессии жизненно важных генов антибиотикорезистентных штаммов распространенных бактериальных патогенов Acinetobacter baumannii и метициллинрезистентных стафилококков (MRSA), принадлежащих, по классификации ВОЗ, к критически важному и важному уровням угрозы здоровью соответственно, были использованы две группы антисмысловых олигонуклеотидов (АОН), относящиеся к разным классам аналогов ДНК/РНК. В первую группу вошли хорошо известные тиофосфатные олигонуклеотиды и разработанные в нашей лаборатории мезилфосфорамидные μ-олигонуклеотиды. Оба этих вида аналогов ДНК сохраняют отрицательный заряд аналогично природным ДНК и РНК. Во вторую группу антисмысловых олигонуклеотидов, использованных в данном проекте, вошли электрoнейтральные фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (ФГО), разработанные под руководством Стеценко Д.А. Ранее нами было показано, что антисмысловые ФГО способны без трансфекционного агента проникать в клетки микобактерий, находящихся внутри макрофагов человека, и избирательно ингибировать экспрессию бактериального гена (Skvortsova, 2019).
В данном проекте были впервые получены представители нового поколения фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов, а именно, ФГО на основе метоксиэтильной РНК (МОЕ-ФГО), для которых ожидается более прочное связывание с РНК-мишенью. В ходе микробиологических экспериментов удалось зарегистрировать эффективное – до 65% – ингибирование роста культуры штамма метициллинрезистентного стафилококка, выделенного у пациента в клинике. Таким образом, в ходе выполнения проекта был достигнут принципиальный результат: была продемонстрирована возможность восстановления чувствительности пенициллинрезистентного штамма стафилококка к антибиотику при помощи олигонуклеотида, избирательно ингибируюшего ген антибиотикорезистентности. При этом эксперимент был поставлен с открытым в 1929 году А. Флемингом первым в истории антибиотиком бензилпенициллином, который утратил свою эффективность в отношение основных бактериальных патогенов десятилетия назад!
Однако, к сожалению, наиболее важный и сложный в клиническом смысле патоген Acinetobacter baumannii пока еще не поддался воздействию антисмысловых олигонуклеотидов в наших руках, но мы планируем продолжить работу в отношение этого патогена. Для этого придется вернуться на одну итерацию назад и вновь провести компьютерный подбор олигонуклеотидных последовательностей к участкам матричной РНК генов-мишеней. Для повышения шансов на успех нам придется провести скрининг способов доставки и выбрать тот из них, который обеспечит наилучшие результаты при проникновении через клеточную стенку грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Публикации
1. Клабенкова К.В., Чалова (Жданова) П.В., Буракова Е.А., Бизяев С.Н., Фокина А.А., Стеценко Д.А. A Convenient Oligonucleotide Conjugation via Tandem Staudinger Reaction and Amide Bond Formation at the Internucleotidic Phosphate Position Int. J. Mol. Sci., опубликована онлайн 12.12.2023 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.20944/preprints202312.0751.v1
2. Фокина А.А., Полетаева Ю.Е, Дукова С., Клабенкова К.В., Радькова З.В., Бакулина А.Ю., Зацепин Т.С., Рябчикова Е.В., Стеценко Д.А. Template-Assisted Assembly of Hybrid DNA/RNA Nanostructures Using Branched Oligodeoxy- and Oligoribonucleotides Int. J. Mol. Sci., 21, 24, 15978 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/ijms242115978