КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 22-13-00160

НазваниеИонные соединения на основе камптотецина и его синтетических производных – новые высокоэффективные ингибиторы человеческой топоизомеразы (hTopI) для лечения онкологических заболеваний

РуководительДьяконов Владимир Анатольевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2022 г. - 2024 г.

Конкурс№68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-101 - Синтез, строение и реакционная способность органических соединений

Ключевые словаКамптотецин, топотекан, ингибиторы человеческой топоизомеразы I, ионные соединения, противоопухолевые препараты, проточная цитометрия, флуоресцентная микроскопия, мультиплексный анализ, опухолевые клеточные линии.

Код ГРНТИ31.21.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
ДНК-модифицирующие ферменты – топоизомеразы регулируют важнейшие жизненные процессы в клетках, а именно транкскрипцию, репликацию, митоз, репарацию нуклеиновых кислот. Подобные ферменты обнаружены у всех про- и эукариот, а также у некоторых вирусов. Топоизомеразы катализируют реакцию релаксации ДНК, введение в ДНК отрицательных и положительных супервитков, а также могут осуществлять реакции сцепления, расцепления и способствовать ренатурации комплементарных колец одноцепочечных молекул ДНК. Вполне обоснованно рассматривать столь важные для биологии опухолевой клетки ферменты как мишени для воздействия противоопухолевых препаратов. Действительно, многие низкомолекулярные химические соединения проникают в ядра клеток и могут взаимодействовать с ДНК или c ДНК-зависимыми ферментами. Этот тип взаимодействий нарушает структуру и функции ДНК, изменяя локальную конформацию макромолекул, а также вызывает разрывы нитей и нарушает матричные синтезы. В ответ на повреждения ДНК нарушается клеточный цикл и жизнеспособность клетки. В результате достигается терапевтический эффект – задержка пролиферации и/или гибель опухолевой клетки. Все топоизомеразы делят на два основных типа, исходя из общих свойств ферментов: топоизомераза I типа вносит в ДНК одноцепочечные разрывы, II типа - двуцепочечные. В настоящее время топоизомеразы I найдены почти во всех живых организмах. Топоизомеразы I из прокариотических клеток способны вызывать релаксацию отрицательно, а из эукариотических - иногда и положительно сверхспирализованной кольцевой замкнутой ДНК. Для своей работы они не требуют никаких кофакторов. Внося разрыв в одну из цепей двойной спирали, фермент ковалентно пришивается к одному из концов цепи, запасая в образованной связи энергию, необходимую для последующего воссоединения этой цепи. Одними из наиболее активных и перспективных препаратов для цитостатической терапии считаются соединения на основе природного алкалоида камптотецина, внедренных и успешно использующихся сегодня в медицинской практике полусинтетических препаратов - иринотекан, топотекан, и др. Камптотецин впервые выделен из коры «Дерева жизни» – Camptotheca acuminata – небольшого реликтового дерева, произрастающего в горных лесах юго-западного Китая. Группа исследователей из Китая в 1985 году первой определила выраженное противоопухолевое действие этого алколоида. Камптотецин оказался невероятно эффективным при лечении экспериментальной лейкемии у лабораторных мышей и только спустя 20 лет было продемонстрировано, что он является специфическим ингибитором топоизомеразы I, стабилизирующим ковалентный комплекс ДНК и топоизомеразы. Между тем, относительно низкий потенциал применения нативного камптотецина кроется в его плохой растворимости в водной среде и, как следствие, его недостаточная биологическая доступность создают серьезные препятствия на пути его широкого применения в клинической практике. В связи с этим весьма актуальными являются исследования, направленные на разработку эффективных подходов и новых синтетических методов для получения полусинтетичеких производных камптотецина, лишенных указанных недостатков - проявляющих высокую избирательность по отношению к биомишеням, обладающих приемлемой водорастворимостью и способностью прохождения через клеточные мембраны, например, получением ионных жидкостей на их основе. Ионные жидкости – это органические соли, обычно состоящие из массивного катиона и более компактного аниона. Чрезвычайно высокое разнообразие представителей данного класса соединений позволяет получать соединения с практически любыми требуемыми характеристиками, благодаря чему ионные жидкости широко применяются в различных областях синтеза, катализа, электрохимии, наук о материалах, биотехнологий и др. Кроме того, присущая ионным жидкостям внутренняя микрогетерогенность также оказывает значительное влияние на их свойства. Относительная простота синтеза ионных жидкостей обеспечивает возможность за короткое время получать наборы веществ как с незначительными, так и с сильными различиями в структурах катионов и анионов. С недавнего времени также активно изучается медицинский потенциал ионных жидкостей в качестве сред доставки лекарств и собственно лекарственных препаратов, кроме того, многочисленными исследованиями показано, что преобразование органических соединений в ионную форму позволяет значительно улучшить их растворимость в водной среде. Однако точные механизмы воздействия ионных жидкостей на живые системы до сих пор изучены слабо. Учитывая вышеизложенное, предлагаемый проект направлен на решение важной и актуальной проблемы, базирующейся на выдвинутой нами идеи по разработке современных высокоэффективных таргетных противоопухолевых препаратов нового поколения ионных соединений на основе камптотецина и его производных, проявляющих высокую ингибирующую активность в отношении человеческой топоизомеразы I. В рамках данного проекта будут проведены исследования по разработке оригинальных препаративных методов направленного стереоселективного синтеза ранее неописанных ионных соединений как на основе камптотецина, так и его производных, что обуславливает высокую новизну и патентную чистоту достигнутых в ходе выполнения настоящего проекта результатов. Для синтезированных соединений планируется проведение испытаний in vitro и in vivo на противоопухолевую активность. На основании полученных данных будут выявлены корреляции между химической структурой ионного соединения и вызываемой им цитотоксической реакцией (в частности, сигнальными каскадами в клетках различного происхождения), что, в свою очередь, позволит отработать модель применения препаратов на основе ионных соединений в персонализированной медицине: в каждом конкретном случае (для каждой клеточной линии) выбрать наиболее эффективное ионное соединение, подобрать и синтезировать ее аналоги с незначительными структурными отличиями и провести скрининг их активностей. Кроме того, нами запланированы полномасштабные исследования по изучению механизмов противоопухолевого действия синтезированных ионных соединений, с привлечением современных методов флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии, иммуногистохимических методов, вестерн-блоттинга и многопараметрического анализа белкового сигналинга по технологии Luminex xMAP.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут разработаны оригинальные методы синтеза уникальных гибридных ионных соединений на основе природного алкалоида камптотецина, а также внедренных и успешно использующихся сегодня в медицинской практике полусинтетических препаратов иринотекан, топотекан, представляющие исключительный интерес в качестве таргетных противоопухолевых препаратов, селективно воздействующих на один из важнейших ферментов клеточного цикла – человеческую топоизомеразу I. Синтезированные молекулы будут исследованы на цитотоксичность, способность индуцировать апоптоз и влияние на клеточный цикл в отношении панели опухолевых и нормальных клеточных линий различного эмбрионального происхождения (HCT 116 (colon carcinoma); A549 (human lung carcinoma); HL60 (promyelocytic leukemia); K562 (myelogenous leukemia); HeLa (epitheloid cervix carcinoma); Hep-2 (HeLa derivative); HEK293 (human embryonic kidney); Jurkat (leukemia); U937 (lymphoma); Normal fibroblasts.), а также камптотецин резистентных клеточных линий. В рамках проекта планируется изучение ингибирующей активности ионных соединений в отношении человеческих топоизомераз I и IIα с привлечением современных методов флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии, иммуногистохимических методов и вестерн-блоттинга. На основании полученных данных будут выявлены корреляции между химической структурой ионного соединения и вызываемой ими цитотоксической реакцией (в частности, сигнальными каскадами в клетках различного происхождения), что, в свою очередь, позволит отработать модель применения препаратов на основе ионных соединений в персонализированной медицине: в каждом конкретном случае (для каждой клеточной линии) выбрать наиболее эффективное ионное соединение, подобрать и синтезировать его аналоги с незначительными структурными отличиями и провести скрининг их активностей, в том числе в экспериментах на лабораторных животных.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Камптотецин (CPT) – это ингибитор топоизомеразы I. Он был открыт в 1966 году М. Э. Уоллом и М. К. Вани при скрининге природных соединений на наличие противоопухолевой тактивности. Впервые это соединение было выделено из коры и стебля Camptotheca acuminata (Camptotheca, Happy tree), дерева, произрастающего в Китае, которое используется в традиционной китайской медицине. CPT в предварительных клинических исследованиях демонстрировал впечатляющую противораковую активность в отношении рака молочной железы, яичников, толстой кишки, легких и желудка. Его основным недостатком является очень низкая растворимость в биологических жидкостях и этот факт сильно ограничивает его применение в клинической практике. Многие химики-синтетики пытались и пытаются синтезировать растворимые аналоги камптотецина. Четыре таких вводорастворимых аналога аналога CPT были одобрены и используются сегодня как химиотерапевтические препараты - топотекан, иринотекан, белотекан и трастузумаб дерукстекан. Биосинтез камптотецина взаимосвязан с метаболитами, которые также участвуют в метаболизме растительных стероидов. Как и многие монотерпеноидные индолалкалоиды, биосинтез камптотецина требует образования стриктозидина, который синтезируется в результате реакции конденсации между трипамином из шикиматного пути и секологанином либо из мевалонатного (MVA), либо из немевалонатного пути (MEP) [Yasuyo Yamazaki, Mariko Kitajima, Masanori Arita, Hiromitsu Takayama, Hiroshi Sudo, Mami Yamazaki, Norio Aimi, Kazuki Saito, Biosynthesis of Camptothecin. In Silico and in Vivo Tracer Study from [1-13C]Glucose, Plant Physiology, Volume 134, Issue 1, January 2004, Pages 161–170, https://doi.org/10.1104/pp.103.029389]. Затем стриктозидин подвергается межмолекулярной циклизации с образованием стриктозамида, который превращается в камптотецин под влиянием сложного ферментативного каскада, который еще пока недостаточно изучен. В ходе реализации данного проекта планируется получить широкую библиотеку ионных соединений на основе камптотецина с различными известными биологически активными соединениями в качестве противоионов. Таким образом, основной идеей авторов является создание ионных соединений, обладающих высоким биологическим потенциалом в отношении опухолевых клеток, повышенной проникающей способностью через биологические мембраны и с комплексным механизмом действия. Авторами проекта были разработаны методы получения прекурсоров ионных соединений – производных камптотецина, содержащих фрагменты имидазола, пиридина, пирролидина и пиперидина как с непосредственным ковалентным связыванием соответствующих производных указанных гетероциклов с молекулами, так и их введение через различные углеводородные спейсеры. На втором этапе с применением разработанных основными авторами проекта реакций Ti-катализируемого кросс-цикломагнирования кислород-содержащих алленов с различными алкил- и арил-замещенными 1,2-диенами с помощью доступных реактивов Гриньяра были синтезированы в достаточном количестве природные и синтетические 5Z,9Z-диеновые кислоты, проявляющие ингибирующую активность в отношении человеческих топоизомераз I и II. Затем на основе синтезированных диеновых кислот и производных камптотецина была синтезирована линейка соединений и изучены основные биологические свойства неописанных ранее ионных соединений. Было изучено цитотоксическое действие синтезированных соединений в отношении опухолевых клеток, показано апоптоз-индуцирующее влияние новых соединений на клеточные линии, влияния на клеточный цикл. Выдвинуто предположение о возможном синергичном действии на индукцию различных видов апоптоза в клетке. In silico показана модель взаимодействия соединения с камптотецином с активным центром фермента топо I.

Публикации

1. Джемилев У.М., Джемилева Л.У., Дьяконов В.А. Металлокомплексный катализ в синтезе регулярных изопреноидов Известия Академии наук. Серия химическая, Т. 72, Вып. 2 (год публикации - 2023)

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Камптотецин (CPT) — это ингибитор ДНК-топоизомеразы I. Он был выделен из коры и стебля Camptotheca acuminata (Camptotheca, Happy Tree), дерева, произрастающего в Китае и используемого в традиционной китайской медицине. Противоопухолевая активность этого алкалоида была показана в 1966 году. Два аналога CPT, топотекан и иринотекан, одобрены для терапии рака. В рамках реализации проекта за 2023 год был разработан принципиально новый метод синтеза N-гетероциклических аналогов мурикадиенина, метаболитами которых является большинство ацетогенинов – известных уникальных соединений, вырабатываемых растениями семейства Аннониевых и рассматриваемых в качестве фаркамакофоров для создания новых ионных соединений на основе камптотецина. Известно, что в природе мурикадиенины встречаются, в основном, в смесях, и выделить чистое вещество для изучения его биологической активности очень сложно, а иногда и невозможно. Уникальность и значимость данного метода синтеза заключается в возможности наработать данные соединения в достаточных количествах для подробного изучения их биологической активности. Мурикадиенины проявляют широкий спектр биологической активности, однако остается еще очень много неизученных вопросов в детальном механизме действия в клетке. Показано, что N-метилпиразольное производное является индуктором апоптоза и оказывает влияние на клеточный цикл по типу ареста, что очень важно для разработки нового класса ионных соединений с противоопухолевой активностью. В развитие этих исследований была выполнена работа по синтезу и изучению цитотоксической активности ионной формы соединений, в сочетании с синтезированной на первом этапе камптотецин-содержащей кислотой. При изучении биологической активности новых ионных соединений удалось выяснить, что цитоксичность синтезированных соединений в 1,5 раза превышала цитотоксичность исходной молекулы камптотецина и камптотецин-содержащей кислоты, а также повышалась водорастворимость новых ионных гибридов. Была получена библиотека ионных соединений на основе природных биологически активных производных литохолевой кислоты, а также синтезирован ряд гибридных молекул на основе литохолевой кислоты и тритерпеноидов с молекулой камптотецина, связанных через спейсеры, а также ранее неописанная димерная молекула камптотецина. Показано, что практически все синтезированные на данном этапе выполнения проекта ионные соединения и гибридные молекулы обладают уникальными свойствами изменять клеточный цикл, блокируя его в начале S-фазы, а также, в большинстве случаев, проявляют высокую ингибирующую активность в отношении человеческой топоизомеразы I в экспериментах in vitro. Все проведенные на этапе проекта в 2023 году исследования позволили моделировать новые ионные соединения на основе камптотецина, а также приступить к изучению структура-активность, являющиеся основной целью данного проекта.

Публикации

1. Джемилева Л.У., Туктарова Р.А., Джемилев У.М., Дьяконов В.А. Pentacyclic Triterpenoids-Based Ionic Compounds: Synthesis, Study of Structure–Antitumor Activity Relationship, Effects on Mitochondria and Activation of Signaling Pathways of Proliferation, Genome Reparation and Early Apoptosis Cancers, Cancers 2023, 15(3), 756 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/cancers15030756

2. Джемилева Л.У., Туктарова Р.А., Джемилев У.М., Дьяконов В.А. Синтез N-гетероциклических аналогов природного мурикадиенина – перспективные противоопухолевые агенты Известия АН. Серия химическая (Russian Chemical Bulletin), - (год публикации - 2024)