Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Все заявленные на первый этап проекта 2022 г. работы полностью выполнены, и запланированные результаты получены. (1) По результатам молекулярного моделирования методами квантовой механики/ молекулярной механики (КМ/ММ) и квантовой химии полностью характеризован механизм фотоиндуцированной реакции гидратации хромофора фотопереключаемого флуоресцентного белка Dreiklang. Данная реакция отвечает за переход активной формы белка (ON) к нефлуоресцирующей форме (OFF). Рассматривались два типа молекулярных моделей данной системы – полная модель белка и 158-атомная кластерная модель, содержащая хромофор и окружающие его группы. Полная модель использовалась для расчетов структур и энергий на потенциальной поверхности основного электронного состояния методом КМ/ММ. Кластерная модель и методы квантовой химии использовались для анализа поведения системы при электронном возбуждении, для нахождения структур на поверхности возбужденного состояния, для поиска точек конических пересечений и для расчетов спектров поглощения от стационарных точек в основном состоянии. Состав кластера соответствовал квантовой подсистеме в расчетах КМ/ММ. Начальный набор координат тяжелых атомов для полной модели был взят из структуры PDB 3ST2, полученной методами рентгеноструктурного анализа. Энергии и силы, действующие на атомы, рассчитывались методом КМ(DFT)/MM(AMBER) с использованием в КМ-подсистеме функционала M06-L и базиса 6-31G* с использованием программы NWChem. Для анализа поведения системы в состоянии ON после возбуждения от точки минимума основного состояния использовалась кластерная модель, описываемая методом SA2-CASSCF(8/6)/6-31G. В этом варианте – первый корень отвечает основному состоянию S0, второй – состоянию с переносом заряда (СТ), т.е. с переносом электрона на хромофор от расположенного рядом аминокислотного остатка Tyr203. Найдена точка конического пересечения, после прохождения которой система попадает на потенциальную поверхность основного электронного состояния. Найдена структура интермедиата реакции на поверхности основного состояния, предполагаемого ранее по результатам фемтосекундных спектральных исследований. Показано, что эта структура соответствует катионной форме хромофора в паре с анионом Tyr203. Переход от интермедиата к продукту реакции гидратации хромофора (состояние OFF) происходит с малым барьером. Построенные молекулярные модели как полной формы белка, так и для молекулярных кластеров, включающих хромофор-содержащую область белка, согласуются с данными рентгеноструктурного анализа для обоих состояний. Рассчитанные методом XMCQDPT2 энергии возбуждения и силы осцилляторов соответствующих переходов для всех найденных точек минимальной энергии хорошо согласуются с наблюдаемыми спектрами поглощения. Содержание работы опубликовано в архиве препринтов открытого доступа по химии (https://chemrxiv.org): Grigorenko B.L., Polyakov I.V., Nemukhin A.V. “Modeling Light-Induced Chromophore Hydration in the Reversibly Photoswitchable Fluorescent Protein Dreiklang», ChemRxiv, November 16, 2022; DOI: 10.26434/chemrxiv-2022-g91vh, (https://chemrxiv.org/engage/chemrxiv/article-details/6373a90677ffe77da4ef0608) (2) Построены молекулярные модели комплексов монооксигеназы RutA с кофактором FMN и молекулами кислорода и урацила. Одну из основных проблем моделирования представляет начальная структура реакционного комплекса RutA-FMN-O2-uracil – методами рентгеноструктурного анализа крайне сложно зафиксировать положение молекулы кислорода в полости белковой макромолекулы, а со стороны молекулярного моделирования необходимо применять подходы, основанные на квантовой теории. В работах по проекту были использованы как методы классической молекулярной динамики (МД), так и методы MД с потенциалами квантовой механики/молекулярной механики (КM/MM MД). В первом случае использовалась программа NAMD с силовым полем CHARMM36 с дополнительными параметрами для молекул FMN и O2, взятыми из литературных данных. Для расчетов методом КM/MM MД использовался оригинальный интерфейс программы NAMD и программы квантовой химии TeraChem. Энергии и силы в квантовой подсистеме (к которой были отнесены реакционные фрагменты FMN, молекулы кислорода и урацила) вычислялись методом теории функционала электронной плотности с функционалом ωB97X с дисперсионной поправкой D3; использовался базис 6-31G** для углерода и водорода и базис 6-31+G** для азота и кислорода. Для описания ММ подсистемы (т.е. для всей оставшейся белковой макромолекулы в сольватных оболочках молекул воды) использовалось силовое поле CHARMM36. Начальные координаты атомов для построения модельных систем были взяты из структуры PDB 6TEG. По результатам моделирования методами МД и КМ/ММ МД данных комплексов показано наличие нескольких областей связывания молекулы O2 в полостях белковой макромолекулы. Отмечены различия в расположении молекулы кислорода около изоаллоксазинового кольца флавина, полученного при моделировании методом КМ/ММ МД и при анализе данных рентгеноструктурного анализа. Для двух вариантов размещения молекулы кислорода около восстановленного флавина показаны направления взаимодействия активированной молекулы кислорода с атомами N5, C4A, C6 изоаллоксазинового кольца флавина. Результаты работы описаны в статье Polyakov I.V., Nemukhin A.V., Domratcheva T.M., Kulakova A.M., Grigorenko B.L. “Quantum-based modeling of protein-ligand interaction: The complex of RutA with uracil and molecular oxygen”, Molecular Informatics (Wiley, IF=3.82), 41, 2200175; DOI: 10.1002/minf.202200175. 3) На примере расчетов свойств комплекса фермента RutA с кофактором FMN и молекулой кислорода проведено тестирование компьютерных программ квантовой химии, квантовой механики/молекулярной механики, молекулярной динамики и связывающих их интерфейсов. Результаты работы описаны в статье Polyakov I.V., Domratcheva T.M., Kulakova A.M., Nemukhin A.V., Grigorenko B.L. “Computational Modeling of the Interaction of Molecular Oxygen with the Flavin-Dependent Enzyme RutA”, Supercomputing Frontiers and Innovations (IF=2.52), 2022, V.9, #2, 46-55. DOI: 10.14529/jsfi220204

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
(A) Механизм фотохимической реакции формирования флуоресцентного состояния в белке Venus66azF. По результатам молекулярного моделирования методами квантовой механики/ молекулярной механики (КМ/ММ) и квантовой химии полностью характеризован механизм созревания хромофора в белке Venus66azF, где вместо Tyr66 была произведена замена на искусственную аминокислоту 4-азидо-L-фенилаланина (azF). Методами КМ/ММ и КМ/ММ МД рассчитаны профили потенциальной энергии и энергии Гиббса для фотоиндуцированного отщепления молекулы азота от азидной группы в структуре интермедиата реакции и окончательное созревание хромофора. Показано, что в окончательном формировании хромофора участвует His148. Результаты моделирования полностью согласованы с экспериментальными данными по масс-спектрам. Работа принята к печати в журнал Organic & Biomolecular Chemistry, Royal Society of Chemistry (IF=3.89, Q1) (B) Механизм фотохимической реакции молекулярного кислорода с флавином в белке miniSOG В данной работе мы рассмотрели небольшой флавинзависимый белок miniSOG (синглетный кислород генератор), который был создан как светоиндуцированный источник синглетного кислорода. Белок miniSOG может быть использован в качестве фотосенсибилизатора для раковых клеток и в качестве маркера для флуоресцентной визуализации. Целью настоящей работы является предсказание мест связывания кислорода в белке miniSOG с помощью молекулярно-динамического моделирования (МД) с использованием как потенциалов силового поля, так и с использованием QM/MM (квантовой механики/молекулярной механики) потенциалов. Результаты настоящего МД-моделирования позволили нам идентифицировать несколько кислород связывающих карманов внутри белковых макромолекул в miniSOG[FMN] и miniSOG[RF]. Для моделирования десять молекул кислорода были помещены в произвольные места вблизи поверхности белка, далее рассчитывались классические МД-траектории с помощью программного пакета NAMD 3.0 с использованием изотермического изобарического (NPT) ансамбля при P = 1 атм и T = 300К с контролем постоянного давления с использованием модифицированного метода Нозе-Гувера, в котором динамика Ланжевена используется для управления колебаниями баростата. Таким образом, результаты настоящего МД-моделирования позволили нам идентифицировать несколько кислородсвязывающих карманов внутри белковых макромолекул в miniSOG[FMN] и miniSOG[RF]. Моделирование проводилось также гибридным методом QM/MM MD позволило нам уточнить места связывания молекулы кислорода вблизи флавинового хромофора для двух вариантов miniSOG (FMN и RF), где молекула кислорода находится на расстоянии около 3,3 Å до центра геометрии изоаллоксазинового кольца хромофора. Очевидно, что это наиболее перспективная структура для изучения генерации активной формы кислорода при световом возбуждении miniSOG. Данный результат используется для дальнейшего моделирования механизма реакции флавина с кислородом. Результаты работы опубликованы в статье: Polyakov I.V., Kulakova A.M., Nemukhin A.V. “Computational Modeling of the Interaction of Molecular Oxygen with the miniSOG Protein—A Light Induced Source of Singlet Oxygen”, Biophysica (MDPI), 2023, V3, N2, pp.252-262, https://doi.org/10.3390/biophysica3020016 (C) QM/MM моделирование механизма реакции флавина в RutА монооксигеназы Данный проект связан с предыдущим тем, что белок RutA также является флавинсодержащим белком, где флавин находится в восстановленной форме. Этот факт делает возможным моделирование на поверхности потенциальной энергии основного состояния, что позволяет нам рассматривать много сценариев взаимодействия молекулярного кислорода с флавином без больших затрат компьютерных ресурсов. Полученная информация поможет в построении модели для белка miniSOG. Были построены молекулярные модели комплексов монооксигеназы RutA с кофактором FMN и молекулами кислорода методами КМ/ММ. Рассматривались разные места захватов молекулы кислорода в активном сайте белка, на основе которых были предложены пять сценариев взаимодействия кислорода с флавином. Были получены разные продукты реакции. Для всех сценариев рассчитывались спектры поглощения S0-S1, которые хорошо согласовались с экспериментальными спектрами абсорбции. Результаты работы доложены на конференции: Одинцов К.В., Домрачева Т.М., Григоренко Б.Л. Моделирование реакций связывания молекулярного кислорода флавином в монооксигеназе EncM. Биокатализ-2023 Суздаль, 25-29 июня 2023 Результаты работы опубликованы в статье: Bella Grigorenko, Tatiana Domratcheva and Alexander Nemukhin “QM/MM Modeling of the Flavin Functionalization in the RutA Monooxygenase” Molecules (MDPI, IF=4,6, Q1), 2023, V28, N5, pp.2405-2422; https://doi.org/10.3390/molecules28052405 (D) Механизм работы обратимо фотопереключаемого флуоресцентного белка Dreiklang Обратимо фотопереключаемый флуоресцентный белок Dreiklang относится к семейству зеленого флуоресцентного белка GFP (green fluorescent protein). В белке Dreiklang хромофор формируется из трипептида Gly65-Tyr66-Gly67 в отличие от мотива Ser65-Tyr66-Gly67 в GFP, мутация в 65й позиции на Gly делает его переключаемым при возбуждении (405 нм (3,06 эВ)) с ON в OFF, и наоборот, (365 нм (3,40 эВ)) OFF → ON. Для анализа поведения системы с нейтральным хромофором после возбуждения от точки минимума основного состояния использовалась 158-атомная кластерная модель, описываемая методом SA2-CASSCF(8/6)/6-31G. В этой работе мы использовали многоконфигурационный метод ССП в варианте полного пространства активных орбиталей (CASSCF) с распределением 8 электронов по 6 орбиталям и с усреднением электронной плотности по двум низшим состояниям (SA2). Был прописан путь реакции, начиная с возбужденного состояния, через точку конического пересечения и переходом на поверхность основного состояния, где был зафиксирован интермедиат, который наблюдался в фемтосекундном эксперименте. Во всех особенных точках на потенциальной поверхности были рассчитаны спектры методом MCQDPT2. Результаты работы доложены на конференции: Поляков И.В., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Квантовохимическое моделирование фотореакции гидратации хромофора флуоресцентного белка Dreiklang, МАТЕМАТИКА. КОМПЬЮТЕР. ОБРАЗОВАНИЕ. МКО-2023, 23-27 января 2023 (устный) Результаты работы опубликованы в статье: Grigorenko Bella L., Polyakov Igor V., Nemukhin Alexander V. “Modeling Light-Induced Chromophore Hydration in the Reversibly Photoswitchable Fluorescent Protein Dreiklang”, Molecules (MDPI, IF=4,6, Q1), 2023, V28, N3, pp.505-517; https://doi.org/10.3390/molecules28020505 (F) Флуоресцентный таймер mRubyFT, запертый в синей форме mRubyFT — это мономерный флуоресцентный таймер, полученный путем мутации из флуоресцентного белка mRuby2. Это флуоресцентный белок, для которого характерно полное созревание синей формы с последующим преобразованием в красную форму. Он имеет более высокую яркость в клетках млекопитающих и более высокую фотостабильность по сравнению с другими флуоресцентными таймерами. Структура высокого разрешения была получена для mRubyFT с хромофором в красной форме, но структурные детали в его синей форме были не ясны. Разрешение рентгеновской структуры позволило предположить конформацию хромофора и его взаимодействие с соседними остатками. Молекулярно-динамическое моделирование с комбинированными КМ/ММ потенциалами продемонстрировало, что синяя форма в основном состоянии существует как а анионной форме, так и в цвитерионной . Как показывают расчеты, эти две формы имеют схожие энергии возбуждения. Кроме того, молекулярно-динамическое моделирование в возбужденном состоянии показало, что флуоресцирует анионное состояние. Результаты работы опубликованы в статье: Boyko Konstantin M., Khrenova Maria G., Nikolaeva Alena Y., Dorovatovskii Pavel V., Vlaskina Anna V., Subach Oksana M., Popov Vladimir O., Subach Fedor V., International Journal of Molecular Sciences (MDPI, IF=5.6, Q1), 2023,V24, N9, p7906-7919; https://doi.org/10.3390/ijms24097906