Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Биопечать является универсальным подходом, имеющим огромный потенциал для применения в тканевой инженерии и современной медицине. Несмотря на значительный прогресс последних лет в тканевой инженерии, технология формирования и мониторинга состояния тканеинженерных конструкций in vivo остается проблемным вопросом. В данном Проекте мы предложили технологию биопечати in situ, то есть непосредственно в месте предполагаемой имплантации тканеинженерной конструкции. В качестве базовой технологии для формирования тканеинженерных конструкций in situ была выбрана фотополимеризация как один из наиболее мощных и быстроразвивающихся подходов. Для этого мы использовали технологию инъекционной экструзии гидрогеля на основе глицидилметакрилата гиалуроновой кислоты в зону дефекта с последующим структурированием с использованием низкоинтенсивного света красного и ближнего инфракрасного диапазона спектра, глубоко проникающего в биоткани, для инициирования процесса полимеризации. Такой подход стало возможным реализовать благодаря разработанной нами технологии кросс-сшивания гидрогеля, где фотоактивация инициатора происходит в «окне прозрачности» биоткани (650-1000 нм). При этом в рамках данного проекта мы развиваем две параллельные стратегии ИК-индуцированной полимеризации: 1) опосредованная апконвертирующими нанофосфорами (АН) полимеризация, сопровождающаяся переносом энергии с АН на молекулы фотоинициатора, возбуждаемого в УФ или синем свете; 2) прямая фотополимеризация с использованием класса соединений, непосредственно возбуждающихся в окне прозрачности биотканей и ранее использовавшихся как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии. В ходе выполнения первого этапа Проекта были разработаны фотополимеризуемые композиции на основе метакрилированной гиалуроновой кислоты. Такие композиции были получены как для технологии АН-опосредованной ИК полимеризации (в качестве фотоинициаторов использовались коммерчески доступные Irgacure и LAP, в качестве АН - апконвертирующие наночастицы со структурой ядро/оболочка NaYF4:Yb3+Tm3+/ NaYF4), так и для технологии прямой полимеризации красным светом (в качестве фотоинициатора использовался синтезированный нами ChlP6PEG). Была показана возможность фотополимеризации предложенных композиций при возбуждении в окне прозрачности биотканей (980 нм для АН-опосредованной полимеризации, 675 нм для прямой полимеризации), оценены основные физические параметры процесса полимеризации, изучена структура полученных скаффолдов и показана их высокая цитосовместимость с использованием культур нормальных (не-опухолевых) клеток. Технология прямой полимеризации с использованием синтезированного ChlP6PEG была выбрана как более перспективная по причине простоты и более высокой скорости полимеризации. Была показана возможность включения живых клеток (кератиноцитов человека) в фотополимеризуемую композицию, содержащую ChlP6PEG, с последующей полимеризацией на длине волны 675 нм. Клетки при этом продемонстрировали высокую выживаемость как в ходе самого процесса фотополимеризации, так и в ходе дальнейшего культивирования (до 5 дней). Выживаемость клеток подтверждали окрашиванием витальным красителем Calcein AM. Была продемонстрирована возможность in situ фотополимеризации в модели малых животных. Для этого фотополимеризуемую композицию, содержащую ChlP6PEG, вводили подкожно и облучали светом с длиной волны 675 нм и интенсивностью до 700 мВт/см2 длительностью до получаса. Состояние экспериментальных животных и сформированного in situ скаффолда наблюдали в течение 4 недель, при этом уже через 14 дней было показано отсутствие воспалительной реакции и существенных структурных изменений в ткани. Также были проведены тестовые эксперименты по биовизуализации скаффолдов in vivo методом прижизненной люминесцентной томографии с использованием системы IVIS Spectrum CT для оценки формы и размера скаффолда, а также начаты эксперименты по оценке уровня воспаления и развития неоваскулатуры в области имплантации скаффолда с использованием оборудования метода растровой оптоакустической мезоскопии высокого разрешения. Для этого были проведены дополнительные эксперименты по импрегнации фотополимеризуемой композиции флуоресцентными красителями и магнитными наночастицами. Было показано, что флуоресцентный сигнал в скаффолде сохранялся в течение всего времени наблюдения (4 недели), а окружающая ткань не несла ярких признаков абнормального развития неоваскулатуры. Таким образом, мы получили подтверждение всех основных тезисов заявки и продемонстрировали возможность реализации предложенного нами подхода in vivo формирования и визуализации тканеинженерных конструкций. Целью следующего этапа Проекта будет систематическое изучение получаемых таких образом тканеинженерных конструкций и оптимизация методов их формирования, включая оптимизацию состава фотокомпозиции и процесса полимеризации тканеинженерной структуры. Также важной частью второго этапа станет сопоставление данных гистологического анализа и данных методов прижизненной визуализации.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Малоинвазивная полимеризация in vivo – сравнительно новый метод, уже продемонстрировавший огромный потенциал для применения в тканевой инженерии и биомедицине. Его принципиальное отличие от стандартного тканеинженерного подхода заключается в том, что полимерная композиция вводится в жидком виде инъекционным способом и формирует скаффолд непосредственно в области дефекта под действием того или иного физического фактора (свет, тепло, pH, присутствие специфических молекул). В данном Проекте мы предложили технологию фотоиндуцируемой in vivo полимеризации, при которой формирование скаффолда запускается под действием света из красной или инфракрасной области спектра. Свет имеет ряд преимуществ по сравнению с другими триггерами процесса полимеризации: возможность проводить химическую реакцию при нормальных условиях, поскольку энергии поглощенного фотона достаточно для преодоления энергетического барьера; возможность активирования реакции в заданное время путем включения источника излучения, что позволяет управлять химической реакцией во времени; возможность фокусировки инициирующего излучения в воксель для управления химической реакцией в объеме композиции. При этом известно, что классический подход с использованием УФ излучения для инициирования реакции фотополимеризации обладает рядом ограничений, к главным из которых относится недостаточная глубина проникновения света в биоткани и вызываемое УФ фотоповреждение клеток. В ходе данного этапа Проекта были получены важные научные результаты, приближающие нас к разработке технологии малоинвазивной фотополимеризации in vivo с использованием красного света. В частности, был разработан протокол синтеза метакрилированных производных желатина (МЖел) и пуллулана (МПул), способных к полимеризации под действием активных форм кислорода. Были синтезированы фотолюминесцентные наночастицы и показана возможность их визуализации в третьем «окне прозрачности» биоткани. Был разработан метод модификации поверхности наночастиц для их включения в материал скаффолдов за счет покрытия положительно заряженными полимерами; в качестве оптимального материала покрытия был выбран N-винилкапролактам. Были исследованы цито- и фототоксичность ряда фотоинициаторов из семейства фталоцианинов и хлоринов. В качестве наиболее перспективного фотоинициатора было выбрано водорастворимое производное фталоцианина Pht, ранее предложенное в качестве антимикробного фотосенсибилизатора. Были подобраны соинициаторы, ускоряющие процесс фотополимеризации – ДТТ и 2-МЭ, их них 2-МЭ был выбран более перспективным ввиду меньшего коэффициентом набухания скаффолдов, полученных с его использованием. Было показано, что модуль Юнга скаффолдов схож со значениями данного параметра для хрящевой ткани. Был оценен размер пор, который находился в интервале от 5-20 мкм до 50-100 мкм. Были предложены подходы по контролируемому изменению размера пор за счет модификации состава композиции и постобработки (криообработка, ферментативная обработка). Был продемонстрирована низкая токсичность полученных скаффолдов и показан рост клеток на их поверхности. Была качественно и количественно продемонстрирована деградация скаффолдов на основе метакрилированной гиалуроновой кислоты (МГК) и ее смеси с МЖел, и МПул в растворе гиалуронидазы in vitro, что предполагает возможность биодеградации таких скаффолдов in vivo. Была показана возможность формирования скаффолдов с геометрически сложной формой методом прямого лазерного рисования. Была разработана установка для in vivo фотополимеризации гидрогелей в малых животных с двумя независимыми источниками излучения и тепловизионной камерой для контроля температуры во время фотополимеризации. Была продемонстрирована воспроизводимость метода фотополимеризации in vivo с использованием различных типов фотокомпозиций: 1) МГК с различной степенью замещения (40% и 50%), 2) фотокомпозиции на основе МГК с добавлением сополимеров (МПул и Мжел), 3) фотокомпозиции с включенными наночастицами с модифицированной поверхностью. Методом прижизненной люминесцентной визуализации и ультразвукового исследования было показано изменение объема и формы полимеризованных скаффолдов в зависимости от времени и состава композиции, методом оптоакустической мезоскопии была исследована сосудистая сеть в биотканях, прилегающих к скаффолду. Было установлено, что оптимальные характеристики при формировании in vivo и последующей биодеградации демонстрируют скаффолды на основе МГК 20% со степенью замещения 40%. Гистологическими методами была доказана биосовместимость скаффолдов на основе МГК: естественная сильная воспалительная реакция на ранних этапах снижалась до умеренной и слабой при интенсивном замещении гидрогеля грануляционной тканью с кровеносными сосудами, уже через неделю после полимеризации гидрогеля. Таким образом, были выполнены все задачи Проекта, поставленные на данном этапе. Целью следующего этапа Проекта будет продолжение оптимизации состава фотокомпозиции, в том числе за счет включения живых клеток, оценка уровня системного и локального воспаления, а также продолжение изучения процессов биодеградации скаффолдов методами прижизненной визуализации. Результаты, полученные в ходе второго этапа Проекта, были представлены в 2 научных статьях; материал о Проекте также вышел в Дайджесте новостей Российского научного фонда #1, 2023 г. (https://rscf.ru/upload/iblock/ad2/h980rjzece4hmv622hzlt6u2hnwcquxh.pdf).