КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

НазваниеIn vivo формирование и визуализация тканеинженерных конструкций

РуководительАкасов Роман Александрович, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)

Организация финансирования, регионФедеральное государственное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр "Кристаллография и фотоника" Российской академии наук", г Москва

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Аннотация
Биопечать является универсальным подходом, имеющим огромный потенциал для применения в тканевой инженерии и современной медицине. Несмотря на значительный прогресс последних лет в тканевой инженерии, технология формирования и мониторинга состояния конечных объектов остается проблемным вопросом. В настоящее время стратегия использования скаффолдов в тканевой инженерии базируется на триаде «формование скаффолда – биоадаптация и заселение клетками – интеграция в живой организм», что является длительным и трудозатратным процессом. В этом проекте мы предлагаем разработать технологии, которые, с одной стороны, позволят за один этап создавать гидрогелевые конструкций с аутологичными клетками непосредственно в организме, а с другой стороны, обеспечат неинвазивный мониторинг состояния тканеинженерной конструкции в условиях in vivo. Для решения проблемы создания тканеинженерной конструкции в живом организме мы предлагаем использовать наши наработки по инициированию процесса полимеризации под действием света ближнего инфракрасного диапазона спектра. Для этого мы будем применять технологию инъекционной экструзии загруженного аутологичными клетками гидрогеля на основе глицидилметакрилата гиалуроновой кислоты в зону дефекта с последующим структурированием с использованием низкоинтенсивного света, глубоко проникающего в биоткани. Такой процесс возможно реализовать благодаря разработанной нами технологии кросс-сшивания гидрогеля, где фотоактивация инициатора происходит в «окне прозрачности» биоткани (650-1000 нм). Для этого мы разработали супрамолекулярный комплекс на основе апконвертирующих наночастиц и эндогенного фотоинициатора рибофлавина и/или хлорина, который возможно фотоактивировать под действием света с длиной волны ~ 700 нм. Для решения проблемы неинвазивного мониторинга предварительно сформированной в условиях in vivo тканеинженерной конструкции будет применяться визуализация на трех уровнях: нано, микро и макроскопическом. Важно, что для формирования тканеинженерных конструкций будут применяться апконвертирующие наночастицы NaYF4:Yb3+,Tm3+, которые могут выступать и как контрастирующий агент для методов фотолюминесцентного биоимиджинга и КТ диагностики. Поскольку технология апконверсии позволяет визуализировать отдельные частицы, мы ожидаем, что предложенный подход позволит анализировать скаффолды и прилегающие ткани на микро- и даже нано-уровне - например, для отслеживания высвобождения наночастиц из скаффолда и их распределения в формирующихся микрососудах. Система IVIS Spectrum CT будет применяться нами для получения фотолюминесцентных и КТ томографических данных, что позволит оценить возможность формирования сложных 3D объектов непосредственно в организме животного. С использованием системы Raster scanning optoacoustic mesoscopy system (RSOM) Explorer P50, методом оптоакустичекого зондирования будет исследоваться процесс формировании неоваскулатуры в области имплантации скаффолда. Важной задачей при этом будет сравнение гистологических данных и данных биоимиджинга, а также сравнение воспаления при введении фотополимеризуемых скаффолдов с модельными способами индукции местного и системного воспаления in vivo. Таким образом, можно сформулировать двойную цель проекта. Во-первых, создание и демонстрация технологии формирования тканеинженерных конструкций непосредственно в живом организме за счет инициирования реакции фотополимеризации гидрогелевых композиций, содержащих аутологичные клетки, при активации светом в окне прозрачности биоткани (650-1000 нм). Во-вторых, разработка неинвазивного подхода, позволяющего оценивать свойства этих тканеинженерных конструкций в условиях in vivo с использованием современных подходов к неинвазивной биовизуализации. В целом проект продемонстрирует новую концепцию биофабрикации и контроля состояния тканеинженерных конструкций в условиях in vivo, а его успешная реализация откроет новые возможности для регенеративной медицины.

Ожидаемые результаты
Мы ожидаем, что в ходе выполнения проекта нам удастся продемонстрировать новую концепцию малоинвазивного in vivo формирования и контроля состояния тканеинженерных конструкций. Это позволит открыть принципиально новые возможности для биотехнологии и медицины. Будет создана и продемонстрирована технология формирования тканеинженерных конструкций непосредственно в живом организме за счет инициирования реакции фотополимеризации гидрогелевых композиций, содержащих аутологичные клетки. Структурирование скаффолда в условиях in vivo будет реализовано благодаря активации процесса кросс-сшивания инжектированого в зону дефекта гидрогеля светом ближнего инфракрасного диапазона спектра, находящемся в так называемом «окне прозрачности» биоткани. Для оценки структуры и состояния сформированных тканеинженерных конструкций будут развиты неинвазивные методы контроля с привлечением современных методов биовизуализации (2D и 3D визуализация с цифровой микротомографией, оптоакустическая преклиническая in vivo визуализация).

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Биопечать является универсальным подходом, имеющим огромный потенциал для применения в тканевой инженерии и современной медицине. Несмотря на значительный прогресс последних лет в тканевой инженерии, технология формирования и мониторинга состояния тканеинженерных конструкций in vivo остается проблемным вопросом. В данном Проекте мы предложили технологию биопечати in situ, то есть непосредственно в месте предполагаемой имплантации тканеинженерной конструкции. В качестве базовой технологии для формирования тканеинженерных конструкций in situ была выбрана фотополимеризация как один из наиболее мощных и быстроразвивающихся подходов. Для этого мы использовали технологию инъекционной экструзии гидрогеля на основе глицидилметакрилата гиалуроновой кислоты в зону дефекта с последующим структурированием с использованием низкоинтенсивного света красного и ближнего инфракрасного диапазона спектра, глубоко проникающего в биоткани, для инициирования процесса полимеризации. Такой подход стало возможным реализовать благодаря разработанной нами технологии кросс-сшивания гидрогеля, где фотоактивация инициатора происходит в «окне прозрачности» биоткани (650-1000 нм). При этом в рамках данного проекта мы развиваем две параллельные стратегии ИК-индуцированной полимеризации: 1) опосредованная апконвертирующими нанофосфорами (АН) полимеризация, сопровождающаяся переносом энергии с АН на молекулы фотоинициатора, возбуждаемого в УФ или синем свете; 2) прямая фотополимеризация с использованием класса соединений, непосредственно возбуждающихся в окне прозрачности биотканей и ранее использовавшихся как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии. В ходе выполнения первого этапа Проекта были разработаны фотополимеризуемые композиции на основе метакрилированной гиалуроновой кислоты. Такие композиции были получены как для технологии АН-опосредованной ИК полимеризации (в качестве фотоинициаторов использовались коммерчески доступные Irgacure и LAP, в качестве АН - апконвертирующие наночастицы со структурой ядро/оболочка NaYF4:Yb3+Tm3+/ NaYF4), так и для технологии прямой полимеризации красным светом (в качестве фотоинициатора использовался синтезированный нами ChlP6PEG). Была показана возможность фотополимеризации предложенных композиций при возбуждении в окне прозрачности биотканей (980 нм для АН-опосредованной полимеризации, 675 нм для прямой полимеризации), оценены основные физические параметры процесса полимеризации, изучена структура полученных скаффолдов и показана их высокая цитосовместимость с использованием культур нормальных (не-опухолевых) клеток. Технология прямой полимеризации с использованием синтезированного ChlP6PEG была выбрана как более перспективная по причине простоты и более высокой скорости полимеризации. Была показана возможность включения живых клеток (кератиноцитов человека) в фотополимеризуемую композицию, содержащую ChlP6PEG, с последующей полимеризацией на длине волны 675 нм. Клетки при этом продемонстрировали высокую выживаемость как в ходе самого процесса фотополимеризации, так и в ходе дальнейшего культивирования (до 5 дней). Выживаемость клеток подтверждали окрашиванием витальным красителем Calcein AM. Была продемонстрирована возможность in situ фотополимеризации в модели малых животных. Для этого фотополимеризуемую композицию, содержащую ChlP6PEG, вводили подкожно и облучали светом с длиной волны 675 нм и интенсивностью до 700 мВт/см2 длительностью до получаса. Состояние экспериментальных животных и сформированного in situ скаффолда наблюдали в течение 4 недель, при этом уже через 14 дней было показано отсутствие воспалительной реакции и существенных структурных изменений в ткани. Также были проведены тестовые эксперименты по биовизуализации скаффолдов in vivo методом прижизненной люминесцентной томографии с использованием системы IVIS Spectrum CT для оценки формы и размера скаффолда, а также начаты эксперименты по оценке уровня воспаления и развития неоваскулатуры в области имплантации скаффолда с использованием оборудования метода растровой оптоакустической мезоскопии высокого разрешения. Для этого были проведены дополнительные эксперименты по импрегнации фотополимеризуемой композиции флуоресцентными красителями и магнитными наночастицами. Было показано, что флуоресцентный сигнал в скаффолде сохранялся в течение всего времени наблюдения (4 недели), а окружающая ткань не несла ярких признаков абнормального развития неоваскулатуры. Таким образом, мы получили подтверждение всех основных тезисов заявки и продемонстрировали возможность реализации предложенного нами подхода in vivo формирования и визуализации тканеинженерных конструкций. Целью следующего этапа Проекта будет систематическое изучение получаемых таких образом тканеинженерных конструкций и оптимизация методов их формирования, включая оптимизацию состава фотокомпозиции и процесса полимеризации тканеинженерной структуры. Также важной частью второго этапа станет сопоставление данных гистологического анализа и данных методов прижизненной визуализации.

Публикации

1. М. Николаева, А. Нечаев, Е. Шмендель, Р. Акасов, М. Маслов, А. Миронов New Cysteine-Containing PEG-Glycerolipid Increases the Bloodstream Circulation Time of Upconverting Nanoparticles Molecules, Molecules 2022, 27(9), 2763 (год публикации - 2022).

2. Савельев А.Г., Сочилина А.В., Акасов Р.А., Шолина Н.В., Савюк М.О., Ярков Р.С., Новожилова М.О., Мищенко Т.А., Ведунова М.В., Звягин А.В., Генералова А.Н., Хайдуков Е.В. Cell-Friendly Hydrogel Fiber Fabrication for Biomedical Applications Материалы международной конференции "6th International Conference on Biomaterials and Biosensors (BIOMATSEN 2021)", Материалы международной конференции "6th International Conference on Biomaterials and Biosensors (BIOMATSEN 2021)", стр. 18-19 (год публикации - 2021).