Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий Проект направлен на разработку бивалентной векторной вакцины для комбинированной защиты от новой коронавирусной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, и гриппа, циркуляция которого продолжается в условиях пандемии COVID-19. В настоящей разработке в качестве вирусного вектора используются аттенуированные вирусы гриппа, которые являются основой отечественной живой гриппозной вакцины (ЖГВ), широко применяющейся в клинической практике для профилактики гриппа у детей старше трех лет и у взрослых без ограничения возраста. Вакцинные штаммы для живой гриппозной вакцины типа А базируются на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Лен/17), для которого ранее были установлены механизмы аттенуации, а также детально изучен вклад каждой аттенуирующей мутации в проявление свойств безвредности и иммуногенности вакцинного вируса. На начальном этапе разработки векторной вакцины от SARS-CoV-2 был проведен отбор его ключевых антигенов для встраивания в вирусный вектор. На основе данных о гомологии вирусов SARS и SARS-CoV-2 были выбраны консервативные участки вирусных белков (главным образом M, N и S), которые были объединены в антигенные фрагменты SARS-CoV-2 и встроены в различные участки генома вакцинных штаммов ЖГВ подтипов H7N9 и/или H1N1. Кроме того, для индукции антител к рецептор-связывающему домену S белка (RBD) были встроены различные модификации данного белка в HA или NS ген вакцинного вируса гриппа. Сборка вакцинных кандидатов с использованием электропорации клеток Vero соответствующим набором плазмид показала, что вирусы гриппа, содержащие только один модифицированный ген, были успешно получены в результате трансфекции в 100% случаев, независимо от того, какой из генов был модифицирован. Вирусы с двумя модифицированными генами NA и NS успешно получены в 65% случаев. Двойные реассортанты с использованием модифицированного HA и либо NA, либо NS удалось получить только в 1 случае из 5, а попытки получить вирус с тремя модифицированными генами пока не увенчались успехом. При этом встроенные в гены вируса вставки сохранялись на протяжении 10 пассажей в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), что указывает на высокую степень генетической стабильности вирусов. Сконструированные химерные вирусы гриппа активно реплицировались в РКЭ, при этом наибольшее влияние на титр вируса в РКЭ оказывает количество вставок и их расположение в разных генах. Наименьшее влияние оказывали вставки в ген NA, а также вставки в NS ген размером до 600 нуклеотидов. Титры вирусов с двумя модифицированными генами были в среднем ниже, чем титры вирусов с теми же вставками, у которых был модифицирован только один из генов. Кроме того, не было обнаружено прямой зависимости эффективности репликации вируса от размера вставки. Наиболее заметное влияние оказывала последовательность вставки – отдельные модификации приводили к низкому титру вирусов в РКЭ и были исключены из дальнейшей работы. Все изученные вакцинные кандидаты проявляли аттенуированный фенотип при интраназальном заражении мышей, при этом, несмотря на отсутствие активной репликации в респираторном тракте мышей у некоторых вакцинных кандидатов, двукратная иммунизация животных приводила к образованию высоких уровней антител, специфичных вирусу гриппа. В целом, уровни анти-RBD IgG антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных химерными вирусами, содержащими вставку RBD фрагмента в генах НА или NS, были на невысоком уровне, однако в некоторых группах титры были достоверно выше отрицательного контроля (мыши, привитые вирусом-вектором без вставок). В отчетном периоде были отработаны методики постановки реакции микронейтрализации коронавируса и выявления вирус-специфических Т-клеток памяти при стимуляции мононуклеаров периферической крови людей живым вирусом SARS-CoV-2. Было показано, что оптимальной дозой вируса SARS-CoV-2 для стимуляции РВМС является доза MOI=0.001, которая позволяла выявлять наибольшую пропорцию цитокин-продуцирующих Т-клеток, как хелперного, так и цитотоксического фенотипа. С использованием разработанных методик была оценена длительность показателей гуморального и Т-клеточного иммунного ответа к SARS-CoV-2 у лиц, перенесших COVID-19 в легкой или средне-тяжелой форме. Было показано, что нейтрализующая активность антител у людей, переболевших в средне-тяжелой форме, сохраняется до 12 мес. после заболевания (период наблюдения), тогда как уровни этих антител у лиц, перенесших COVID-19 в легкой форме, значительно снижаются уже через полгода после выздоровления. Также было показано, что вирус-специфические CD4 Т клетки персистируют в циркуляции у переболевших людей вплоть до 12 месяцев после заболевания, тогда как цитотоксические Т клетки являются короткоживущими, и их уровни существенно падают уже через 2 месяца после инфицирования. В целом, разработанная методика позволит выявлять SARS-CoV-2-специфические Т клетки как у людей, так и у животных, иммунизированных сконструированными вакцинными кандидатами. Одним из ключевых этапов разработки вакцинного препарата, предназначенного для массового применения в практике здравоохранения, является отработка процесса его промышленного производства. В настоящее время подавляющее большинство противогриппозных вакцин производится на развивающихся куриных эмбрионах, тогда как успешная платформа для создания векторных вакцин должна базироваться на клеточных технологиях, с возможностью быстрого масштабирования производства в условиях пандемии. Проведенные в отчетном периоде исследования позволили рекомендовать клеточную линию MDCK в качестве субстрата для наработки вакцины в производственных масштабах: данная культура клеток поддерживала уровень репликации рекомбинантных вирусов гриппа, достаточный для наработки необходимого количества инфекционных единиц на биореакторах.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На предыдущем этапе исследования нами была сконструирована панель рекомбинантных вакцинных вирусов гриппа, кодирующих в своем геноме различные иммуногенные фрагменты SARS-CoV-2. В настоящем отчетном периоде были завершены исследования безопасности, иммуногенности и протективной активности наиболее перспективных вакцинных кандидатов в экспериментах на сирийских хомячках и хорьках. Эти исследования показали, что прототипы бивалентной вакцины от SARS-CoV-2 и гриппа, сконструированные на основе модельного вакцинного штамма пандемической живой гриппозной вакцины (ЖГВ) подтипа H7N9, являются безвредными, иммуногенными и могут обеспечить комбинированную защиту животных от двух актуальных респираторных вирусов. Однако ввиду того, что новый коронавирус подвержен достаточно высокому уровню эволюционной изменчивости, были проведены дополнительные исследования по оптимизации вакцинных кандидатов с целью разработки прототипа с широким спектром действия в отношении различных антигенных вариантов SARS-CoV-2. Кроме того, были сконструированы новые вакцинные кандидаты на основе современных сезонных вирусов гриппа подтипов H1N1 и/или H3N2, в которых закодированы полиэпитопные кассеты, содержащие наиболее консервативные и иммуногенные Т-клеточные эпитопы коронавируса, с целью последующей разработки трехвалентной комбинированной живой гриппозной вакцины для сезонной профилактики гриппа и COVID-19. Было показано, что химерные вирусы гриппа H1N1 и H3N2 с легкостью собираются методами обратной генетики, что позволит в дальнейшем регулярно актуализировать трехвалентную комбинированную живую гриппозную вакцину для сезонной профилактики гриппа и COVID-19 при антигенном дрейфе вирусов гриппа. Поскольку проведение клинических испытаний наиболее предпочтительно с использованием вакцинных кандидатов, сконструированных на основе сезонных штаммов ЖГВ, было принято решение о проведении полного цикла доклинических исследований вновь сконструированных вакцинных кандидатов на основе вирусов подтипа H1N1 и H3N2. В настоящем отчетном периоде была проведена отработка методик постановки вирусологических и иммунологических реакций для использования в дальнейших доклинических и клинических исследованиях. В частности, разработаны и апробированы протоколы для генотипирования вариантов коронавируса с помощью метода пиросеквенирования, которые позволяют одномоментно идентифицировать варианты альфа, бета, гамма, дельта, омикрон в биологических жидкостях. Кроме того, отработаны условия для оценки уровней вирусспецифических клеток методом ELISpot на модели сирийских хомячков, а именно – определены оптимальные дозы вируса SARS-CoV-2 для стимуляции иммунных клеток, позволяющие выявлять максимальные уровни цитокин-продуцирующих клеток. Также детальное изучение патологических изменений в тканях легких хомяков, зараженных SARS-CoV-2, позволило выявить наиболее чувствительный морфометрический параметр, прямо коррелирующий с выраженностью вирус-индуцированной патологии, а именно – толщина межальвеолярных перегородок. Использование данного показателя позволяет определить даже незначительные различия в степени выраженности вирус-индуцированной патологии, что может быть критическим при доклинической оценке профилактических и терапевтических препаратов от COVID-19. Важным результатом является разработанная методология детекции вируса SARS-CoV-2 с помощью оригинальных биотинилированных моноклональных антител к N белку, универсально распознающих все линии коронавируса, с последующим усилением сигнала при помощи конъюгата стрептавидин-FAM. Разработанная методика позволяет определять титр вируса с помощью подсчета флюоресцирующих фокусов на ранних стадиях после заражения, что, в свою очередь, позволит быстро и достоверно определять нейтрализующую активность сывороток крови людей и иммунизированных животных в отношении любого варианта коронавируса.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На предыдущем этапе исследования были сконструированы вакцинные кандидаты на основе современных сезонных вирусов гриппа подтипов H1N1 и H3N2, в гене нейраминидазы которых закодированы полиэпитопные кассеты, содержащие наиболее консервативные и иммуногенные Т-клеточные эпитопы коронавируса. В настоящем отчетном периоде была проведена оценка безвредности, иммуногенности и протективной активности бивалентной вакцины, подготовленной на основе сезонного штамма вируса гриппа H3N2, в эксперименте на макаках резус, а в качестве препарата сравнения выступал соответствующий классический штамм живой гриппозной вакцины (ЖГВ) без модификаций. Было показано, что двукратное интраназальное введении вакцины не оказывало токсического действия на физиологические показатели обезьян, включая температуру и массу тела, а также клинические и биохимические показатели крови. Последующее заражение иммунизированных животных живым коронавирусом SARS-CoV-2 линии Delta показало, что у инфицированных вакцинированных животных в течение периода наблюдения не было выявлено снижения массы тела, повышения температуры, а летальность отсутствовала. По всем показателям было подтверждено отсутствие эффекта антителозависимого усиления инфекции (ADE-эффект) у живой рекомбинантной векторной вакцины на основе аттенуированного штамма вируса гриппа. Оценка иммуногенных свойств исследуемых вакцинных штаммов в эксперименте на макаках резус выявила достоверно более высокую иммуногенность в отношении антигенов вируса гриппа у рекомбинантного штамма бивалентной вакцины в сравнении с классическим вакцинным штаммом ЖГВ, что соответствует полученным нами ранее данным об усилении иммуногенных свойств вакцинных штаммов ЖГВ при встраивании в их геном иммуногенных Т-клеточных эпитопов других респираторных вирусов. Кроме того, была показана способность химерного вируса стимулировать Т-клеточный иммунитет к эпитопам N белка коронавируса, что указывает на способность бивалентной вакцины стимулировать иммунный ответ к двум целевым патогенам. Среди панели сконструированных рекомбинантных штаммов вирусов гриппа подтипов H1N1 и H3N2, кодирующих различные фрагменты консервативных участков белков SARS-CoV-2, были выбраны прототипы с наилучшими ростовыми характеристиками в культуре клеток млекопитающих, поскольку в дальнейшем планируется наработка трехвалентной комбинированной живой гриппозной вакцины для сезонной профилактики гриппа и COVID-19 с использованием суспензионных линий клеток. Для отобранных рекомбинантных штаммов было проведено доклиническое исследование безопасности, иммуногенности и протективной активности в отношении вирусов гриппа и коронавируса SARS-CoV-2 на модели сирийских хомячков, где в качестве контрольных препаратов выступали соответствующие штаммы классической ЖГВ подтипов H1N1 и H3N2. Проведенный анализ физиологических, клинико-лабораторных и морфологических показателей сирийских хомячков установил, что тестируемые объекты при интраназальной двукратной иммунизации не оказывали токсического действия на организм животных. Оба рекомбинантных штамма индуцировали выраженный системный гуморальный иммунный ответ к антигенам вируса гриппа, не уступая по этому показателю классическим штаммам ЖГВ. Этот уровень иммунитета обеспечил защиту иммунизированных животных от заражения гомологичными вирусами гриппа. Также была показана способность химерных вирусов гриппа защищать иммунизированных животных от размножения коронавируса в носовых ходах животных, что может в дальнейшем предотвратить передачу вируса в коллективе, даже при отсутствии полной защиты привитых от естественной инфекции. В отчетном периоде также была разработана поливалентная вакцина, направленная на защиту привитых от сезонных вирусов гриппа А/Н1N1, A/Н3N2 и В, а также от коронавируса SARS-CoV-2. Вакцинные штаммы были наработаны в развивающихся куриных эмбрионах в лабораторных условиях, объединены в трехвалентный препарат в соответствующих дозировках, и готовая смесь была использована для проведения доклинических исследований на модели сирийских хомяков, где оценивалась безопасность вакцины, её иммуногенность и способность защищать животных от гриппозной и коронавирусной инфекций. Была показана безвредность вакцины и способность стимулировать защитный иммунитет ко всем трем вариантам вируса гриппа, а также в отношении новой коронавирусной инфекции. На следующем этапе работы будет проводиться отработка технологии промышленного производства разработанной трехвалентной сезонной комбинированной вакцины на суспензионных клеточных культурах в сотрудничестве с индустриальным партнером проекта – биотехнологической компанией АО «БИОКАД». В рамках этих разработок будут получены экспериментальные серии вакцины, которые позволят завершить требуемые доклинические исследования и подготовить досье для получения разрешения на проведение клинических испытаний вакцины на добровольцах.