Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проект направлен на поиск новых сигнальных молекул, каскадов и регуляторов генной экспрессии, ассоциированных с развитием ожирения и сахарного диабета 2 типа (СД2Т), а также на исследование изменений уровня транскриптомного профиля и фосфорилирования множества сигнальных молекул, возникающих в скелетной мышце при стимуляции эндогенным инсулином у людей с ожирением с и без СД2Т. На первом этапе был проведен набор 10 добровольцев включая 4 здоровых мужчин (H), 3 пациентов с ожирением (Ob; 2 мужчин и 1 женщина), и 3 пациентов (мужчины) с ожирением и диагностированным СД2Т (Ob+T2D).. Рекрутирование пациентов с ожирением и ожирением и СД2Т и эксперименты с их участием были выполнены на базе Института диабета ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России. Эксперименты с участием здоровых добровольцев были выполнены на базе ГНЦ РФ-Института медико-биологических проблем РАН. Для этого были получены положительные решения локального этического комитета ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России и комиссии по биомедицинской этике ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Все добровольцы подписали добровольное согласие на участие в экспериментальном исследовании. Индекс массы тела (ИМТ) был значительно выше в группах Ob и Ob+T2D, чем в группе Н, отражая наличие ожирения 2-й и 3-й степени. Субъективная оценка двигательных возможностей (анкета SF-12) в обеих группах пациентов была ниже, чем у здоровых. Уровень глюкозы крови натощак и гликированного гемоглобина были выше нормы только у СД2Т. В группе с ожирением наблюдался характерный признак предиабета – высокий уровень инсулина натощак при нормальном уровне глюкозы в крови. Анализ липидного профиля не выявил различий между группами. Концентрация лейкоцитов и нейтрофилов были выше у людей с ожирением, чем у контрольной группы; тем не менее, эти показатели были в пределах нормы во всех группах. Для исследования ответа на увеличение концентрации эндогенного инсулина в крови был проведен тест с приемом смешенной пищи (пищевая смесь Nestle Resource 2.0; 3 мл/кг массы тела). Пробы венозной крови были взяты до, через 30, 60, 90, 120 и 180 мин после приема пищи. Пробы ткани были взяты пробы из m. vastus lateralis с помощью игольчатой биопсии для проведения протеомного, фосфопротеомного и транскриптомного анализов, запланированных на второй этап работы по Проекту. В ответ на прием смешанной пищи у здоровых людей наблюдалось небольшое увеличение концентрация глюкозы крови только через 30 минут после приёма пищи; при этом уровень инсулина и C-пептида достигал пика через 30-60 мин после приёма пищи и через 3 часа снижался к исходному уровню. У пациентов с ожирением (Ob группа) пиковый уровень глюкозы после приёма пищи был сопоставим с контролем, но при этом, в отличие от здоровых людей, концентрация глюкозы не возвращалась к исходному уровню. Это происходило несмотря на предельно высокий уровень инсулина (около 200 мкМЕ/мл) и С-пептида в крови, поддерживаемый на протяжении всех трех часов теста. У пациентов с СД2Т прием пищи вызвал значительно больший прирост глюкозы в крови по сравнению с другими группами (на 3 ммоль/л vs. 1 ммоль/л). Это было связано с тем, что прирост инсулина и С-пептида у пациентов с СД2Т был значительно меньше, чем у пациентов с ожирением. Таким образом, у людей с ожирением были обнаружены выраженные признаки инсулиновой резистентности, выражаемые в крайне выраженном увеличении содержания инсулина в ответ на прием смешанной пищи, нормированной на массу тела. Напротив, у пациентов с ожирением и СД2Т, несмотря на значительный прирост глюкозы крови, увеличение содержания инсулина было крайне низкое и сопоставимое с тем, что наблюдается в группе здоровых людей. Такой удачный подбор пациентов позволит провести корректное сопоставление инсулин-индуцированных молекулярных ответов скелетных мышц, которое запланировано на второй этап работы по Проекту. Это должно позволить оценить масштабные изменения фосфорилирования множества сигнальных белков, вызванные инсулином (быстрые ответы), и самые первые изменения, возникающие в транскриптоме. Последующий биоинформатический анализ этих данных позволит связать инсулинозависимые изменения в сигнальных путях с изменениями в генной экспрессии и предсказать транскрипционные факторы, соединяющие эти два уровня регуляции.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В норме скелетные мышцы составляют 30-40% массы тела и играют ключевую роль в регуляции углеводного и жирового обмена в организме. Проект направлен на поиск новых регуляторных механизмов, связанных с развитием ожирения и сахарного диабета 2 типа (СД2Т), а именно на изучение изменений в фосфорилировании сигнальных молекул, в активации транскрипционных факторов и в профиле генной экспрессии, при стимуляции эндогенным инсулином в скелетной мышце людей с ожирением без и с СД2Т. Второй этап работы по Проекту посвящен исследованию нарушений раннего транскриптомного ответа на смешанный прием пищи. Для этого у 7 здоровых добровольцев (Н), 8 пациентов с ожирением (Ob) и 10 пациентов с ожирением и СД2Т (Ob+T2D) через 1 ч после приема смешанной пищи, нормированной на массу тела (моделирование типового приема пищи) изучали транскриптомный ответ m. vastus lateralis. Анализ базальных показателей показал, что добровольцы из группы Ob и Ob+T2D имеют нарушения (индекс инсулинорезистентности HOMA, уровень С-пептида и инсулина, глюкозы и гликированного гемоглобина натощак), характерные для ожирения и СД2Т, соответственно. Тест с нормированным приемом смешенной пищи выявлял значительные нарушения в динамике глюкозы, инсулина и С-пептида в крови при ожирении и сахарном диабете 2 типа. Скорость прироста глюкозы и С-пептида через час после приема пищи хорошо разделяла пациентов с ожирением без и с диабетом 2 типа, что связано с нарушениями, как в инсулинозависимом захвате глюкозы тканями, так и в скорости секреции инсулина, вызванной дисфункцией бета-клеток. После приема пищи наблюдалось изменение экспрессии 120 мРНК в группе Н, 84 мРНК в группе Ob и 54 мРНК в группе Ob+T2D, отмечалось слабое перекрытие ДЭГ между группами. Среди ДЭГ раннего ответа в Н выделяются регуляторы транскрипции, киназы, фосфатазы, цитокины и факторы роста. Эти гены кодировали белки клеточной мембраны, секретируемые белки, регуляторы транскрипции, пролиферации клеток, ангиогенеза и биологических ритмов. ДЭГ в Ob были ассоциированы с регуляторами транскрипции, которые мало пересекались с таковыми в группе H. В Ob+T2D ранний транскриптомный ответ оказался ассоциирован с секретируемыми белками и внеклеточным матриксом. Суммарно наши результаты показывают, что ожирение и СД2Т не только снижают постпрандиальный генный ответ в скелетной мышце, но также индуцируют экспрессию других генов, некоторые из которых связаны с инсулинорезистентностью и СД2Т. При помощи метода позиционных весовых матриц мы идентифицировали обогащенные мотивы связывания с транскрипционными факторами для промоторов ДЭГ, что позволило предсказать факторы транскрипции, участвующие в генном ответе на прием смешанной пищи. В контрольной группе для генов, снизивших экспрессию, наиболее обогащены были мотивы факторов семейства POU2 (в 2 раза больше, чем другие мотивы), а также мотивы факторов семейств TEAD, SMAD, MECP, факторы цинковых пальцев C2H2, MAX, TBX, FOX, RAR, IRX, GATA, TFAPs и MAF, тогда как для генов, активируемых в ответ на приём пищи – факторы цинковых пальцев C2H2, HOX и FOX. В обеих группах пациентов было обнаружено значительно меньшее количество факторов; при этом они отличались от тех, что были обнаружены для контрольной группы. Используя данные о дифференциально экспрессируемых генах, предсказанных факторах транскрипции и белок-белковых взаимодействиях, описанных в литературе, мы построили сеть белок-белковых взаимодействий. Было показано, что в контрольной группе наиболее яркие изменения ассоциированы с рецепторными тирозинкиназами, связанными с инсулиновым сигнальным каскадом, и с многочисленными регуляторами транскрипции. Оказалось, что при ожирении и СД2Т эти сигнальные сети плохо регулируется на уровне транскрипции. На следующем (финальном) этапе работы по Проекту обнаруженные изменения в транскриптомном ответе и в активации транскрипционных факторов будут сопоставлены и изменении фосфопротеома. Это позволит выявить сигнальные каскады, ответственные за развитие метаболических нарушений в скелетной мышце при ожирении и СД2Т.