Аннотация результатов, полученных в 2021 году
МСК представляют собой популяцию стволовых клеток взрослого организма, участвующих в поддержании тканевого гомеостаза. Они активно взаимодействуют с другими типами клеток, регулируя их деятельность. С возрастом функциональная активность этой и других клеточных популяций может изменяться. Активация сенесцентного («стареющего») состояния приводит к значительным морфо-функциональным перестройкам, что ведет к нарушению межклеточной коммуникации и многим системным последствиям для всего организма. Конкретная роль МСК в этих процессах остается малоизученной. Особенно мало данных о влиянии сенесцентных МСК на клеточные и неклеточные элементы тканевой ниши. Поиск способов модуляции регуляторных функций данной клеточной популяции имеет крайне важное значение. Одним из таких способов может быть применение геропротекторных цитокинов, таких как GDF11. На сегодняшний день этот белок продемонстрировал ряд положительных эффектов, что обуславливает необходимость дальнейших исследований на уровне отдельных клеточных популяций. Среди конкретных задач проекта можно выделить следующие: 1) изучение регуляторных функций сенесцентных МСК на модели взаимодействия с эндотелиальными клетками (ЭК); 2) оценка геропротекторных свойств GDF11 при воздействии на МСК; 3) изучение возможности модификации методов культивирования МСК с целью усиления их репаративных свойств; 4) анализ транскриптомных и протеомных изменений, ассоциированных со старением и воздействием GDF11. В 2021 году эксперименты проводили на иммортализованных стандартных линиях МСК (ASC52telo - ATCC® SCRC-4000™) и ЭК (EA.hy926 - ATCC® CRL-2922™). Данные клеточные лини предоставлены на некоммерческой основе из клеточного депозитария в рамках проекта "Ноев ковчег" МГУ имени М.В. Ломоносова. Особую благодарность за это мы выражаем Ткачуку В.А. и сотрудникам его лаборатории на ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова. Для получения сенесцентных МСК применяли подход стресс-индуцированного старения с помощью митомицина С (МмС). МмС генерирует кислородные радикалы (АФК) и алкилирует ДНК, чем способствует возникновению межцепочечных и внутрицепочечных поперечных связей. Анализировали морфологию, аутофлуорсценцию, активность лизосомального и митохондриального компартментов, уровень АФК. Отмечены морфофункциональные изменения, характерные для клеточного старения. 10 дней культивирования после воздействия МмС в полной ростовой среде с добавлением GDF11 приводило к снижению выраженности некоторых проявлений клеточного старения. Наиболее выраженные отличия были выявлены по аутофлуоресценции, которая зависит от многих факторов, включая размер клеток и количество внутриклеточного липофусцина. Дополнительно был изучен протеомный профиль исследуемых МСК. В образцах лизатов МСК выявлено от 3100 до 3184 белков на образец. При анализе различий в уровне белков в образцах лизата МмС- и МмС+ МСК выявлено 765 белков, уровни которых различаются у «молодых» и сенесцентных клеток. Далее изучали децеллюрязированный внеклеточный матрикс (дцВКМ) и кондиционированную среду (КС) от исследуемых МСК. Содержание про-коллагена 1α1 в кондиционированной среде от сенесцентных МСК было значительно снижено (в 10 раз) по сравнению с «молодыми» МСК, что подтверждалось и на уровне транскрипции. В образцах экстрагированного ВКМ выявлено около 100 белков с помощью масс-спектрометрии. Было обнаружено, что в матрисоме МмС+ МСК снижено содержание структурных белков ВКМ: коллагенов (COL1A2, COL5A1, COL6A1-A3, COL12), гликопротеинов (FBLN1, FBLN2, FBN1, POSTN, THSP4), протеогиканов (GPS2, GPS6, GSPG4, MFAP5, MXRA5). Также уменьшилось число ферментов, отвечающих за организацию коллагеновых и эластиновых фибрилл (PLOD1, NEP и др.). При анализе влияния фактора GDF11 на белковый состав ВКМ МСК выявлено, что у ММС+/GDF11+ МСК относительно ММС+/GDF11- повышается уровень 3 белков (UGDH, MYO1C, SRGN). А у МмС-/GDF11+ относительно МмС-/GDF11- повышается уровень 4 белков (LOXL2, LOYX, DBN1, PGM5). С помощью мультиплексного анализа КС выявлено, что обработка МмС запускает выраженную продукцию GM-CSF, G-CSF и MIP-1a. Более чем в 2 раза повышалась концентрация MCP-3, IL-6, GROa, FGF-2. Снижались FLT-3L, IP-10, IL-5. Обработка GDF11 приводила к снижению содержания IL-8, GROa, MCP-1 в сенесцентных клетках. Для анализа изменений на транскрипционном уровне использовали количественный ПЦР анализ. Обработка МмС более чем в 2 раза повышает транскрипционную активность 24 генов (IL1B, IL1A, CSF2, IL11, LIF, CXCL1 и др.) и снижает 13 (PTN, IGF1, NRG2 и др.). Обработка GDF11 сенесцентных клеток повышала экспрессию 4 генов (LEFTY1, NDP, PTN, TYMP) и снижала 3 (IL18, NRTN, MDK). Следующий этап исследования был посвящен анализу ответа ЭК на факторы микроокружения, создаваемые сенесцентными МСК. Мы не обнаружили изменений в морфологии клеток и пролиферативной активности ЭК, после сокультивирования с МСК во всех 4 группах. Миграционная активность сокультуры достоверно снижалась на 20% в группе МСК(МмС+/GDF11-)/ЭК. GDF11 оказывал стимулирующие действие на закрытие «раны» в группах МСК(МмС-/GDF11+)/ЭК и МСК(МмС+/GDF11+)/ЭК. При анализе паракринного профиля в КС от сокультуры МСК(МмС-/GDF11-)/ЭК наблюдалось достоверное увеличение содержания проангиогенных цитокинов (Eotaxin, FGF-2, GM-CSF, GROa, IL-6, IL-8, MCP-1, MCP-3, PDGF-AA, RANTES, VEGF-A, G-CSF), по сравнению с монокультурой ЭК. Культивирование МСК с митомицином приводило к достоверному увеличению в КС от МСК(МмС+/GDF11-)/ЭК: FGF-2, GM-CSF, MCP-3, PDGF-AA, RANTES, G-CSF и снижению MCP-1, Eotaxin, IL-8, GRO. Концентрация IL-6 и VEGF достоверно не изменялась. Добавление GDF11 в основном приводило к восстановительным эффектам, так в кондиционированной среде от (МмС+/GDF11+)/ЭК отмечалась тенденция к снижению FGF-2, MCP-3, PDGF-AA и увеличению MCP-1, VEGF. Оценили ответ ЭК на секретом и дцВКМ сенесцентных МСК. Мы не обнаружили изменений в морфологии клеток и жизнеспособности у ЭК, после культивирования клеток в КС от МСК во всех 4 группах. Однако отмечались изменения в клеточном приросте ЭК. Так, клетки, культивируемые в КС от МСК(МмС+/GDF11-) показывали достоверно меньший прирост (в 1,5 раза). После культивирования ЭК в КС от МСК(МмС+/GDF11-), уровень окислительного стресса увеличивался, а активность лизосомального компартмента снижалась. Предварительное добавление к МСК GDF11 (МмС+/GDF11+) компенсировало все ранее наблюдаемые эффекты у ЭК. После добавления КС от МСК(МмС+/GDF11-), «рана» в ЭК монослое закрывалась достоверно быстрее, чем после добавления КС от МСК(МмС-/GDF11-). GDF11 не оказывал стимулирующего действия на закрытие «раны» от КС в группах МСК(МмС-/GDF11+) и МСК(МмС+/GDF11+) по сравнению с соответствующей группой МСК (GDF11-). Оценка эффектов дцВКМ. Полученные препараты дцВКМ от МСК (MмC-) и (MмC+) имели различную структуру. ВКМ от МСК (MмC-) образовывал единую плотную сеть пересекающихся волокон. После децеллюляризации в MmC+ препаратах оставались разъединенные «островки» тонких фибрилл ВКМ. После 48 часов культивирования ЭК на дцВКМ (MмС-) распределялись равномерно, тогда как на дцВКМ (МмС+) демонстрировали образование сетчатых структур. Клетки мигрировали к фибриллам дцВКМ. Измерения числа узлов и пересечений, а также числа разветвлений в сети, образуемой ЭК, выявило снижение первых и увеличение вторых на MмC+/GDF+ дцВКМ по сравнению с MмC+/GDF-. Таким образом, показаны значительные изменения в физиологии МСК, их протеоме, секретоме и транскриптоме при активации клеточного старения. Как при прямом сокультивировании, так и при добавлении секретома или дцВКМ, отмечено влияние на ЭК. GDF11 продемонстрировал антисенесцентное влияние на ряд признаков, ассоциированных с клеточным старением..

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Второй этап Проекта был посвящен анализу влияния сенесцентных первичных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) на эндотелиальные клетки (ЭК), а также на выявлении эффектов GDF11. МСК представляют собой популяцию стволовых клеток взрослого организма, участвующих в поддержании тканевого гомеостаза. Они активно взаимодействуют с другими типами клеток, регулируя их деятельность. С возрастом функциональная активность этой и других клеточных популяций может изменяться. Активация сенесцентного («стареющего») состояния приводит к значительным морфофункциональным перестройкам, что ведет к нарушению межклеточной коммуникации и многим системным последствиям для всего организма. Конкретная роль МСК в этих процессах остается малоизученной. Особенно мало данных о влиянии сенесцентных МСК на клеточные и неклеточные элементы тканевой ниши. Поиск способов модуляции регуляторных функций данной клеточной популяции имеет крайне важное значение. Одним из таких способов может быть применение геропротекторных цитокинов, таких как GDF11. На сегодняшний день этот белок продемонстрировал ряд положительных эффектов, что обуславливает необходимость дальнейших исследований на уровне отдельных клеточных популяций. На втором этапе Проекта проводили эксперименты на первичных культурах МСК и ЭК, выделенных из пупочных канатиков. Для активации сенесцентного состояния МСК применяли подход стресс-индуцированного старения с помощью митомицина С (МмС). МмС генерирует кислородные радикалы (АФК) и алкилирует ДНК, чем способствует возникновению межцепочечных и внутрицепочечных поперечных связей. Анализировали морфологию, аутофлуорсценцию, активность лизосомального и митохондриального компартментов, уровень АФК. Отмечены морфофункциональные изменения, характерные для клеточного старения. GDF11 через 10 дней после отмены МмС не оказывал значительного влияния на большинство анализируемых параметров. Тем не менее зафиксировано снижение АФК на 10-20% в МмС- культурах, что может указывать на снижение окислительного стресса. Обнаруженные изменения (как при старении, так и при воздействии GDF11) имели свои особенности, если проводить сравнение с иммортализованными линиями, которые использовали на первом этапе Проекта. В сравнении с первым годом, показаны более значительные изменения и в физиологии ЭК полученных из пупочного канатика, их транскриптоме и трофической активности, как при прямом сокультивировании с сенесцентными МСК так и через их паракринные медиаторы. GDF11 продемонстрировал значительное нивелирование у первичных ЭК ряда признаков, ассоциированных с клеточным старением. После 10 дней культивирования под монослоем первичных МСК накапливается слой фибриллярного ВКМ, который сохраняется после децеллюляризации. Однако у сенесцентных клеток снижается продукция структурных молекул, и увеличивается потенциал к деградации. Это было установлено как на уровне генов, так и на уровне белка. На препаратах МмС+ дцВКМ были отмечены разреженные молекулы. Однако депонирующая способность VEGF и CTGF в сенесцентном дцВКМ была увеличена. При этом воздействие GDF11 значительно не повлияло на матрисом пкМСК. Для иммортализованных МСК были выявлены подобные изменения в продукции структурных и регуляторных молекул ВКМ. Однако депонирование VEGF в сенесцентном дцВКМ было снижено. После заселения первичных ЭК на различные подложки дцВКМ показано, что на сенесцентном дцВКМ увеличивалось количество АФК, а также повышается активность лизосомального и митохондриального компартментов. Для иммортализованных же культур не было выявлено увеличение АФК. Однако GDF11 снижал данные показатели в обеих экспериментальных моделях. Активация первичных культур ЭК не происходила на различных подложках дцВКМ, однако в предыдущем году были изменения в экспрессии ICAM, VCAM и E-селектина. При анализе профиля цитокинов у ЭК на дцВКМ были выявлены изменения среди проангиогенных факторов. На сенесцентном дцВКМ первичных культур у ЭК снижалась продукция HGF, а у иммортализованных клеток - продукция FGF-2 и PDGF-AA. Эффекты GDF11 при культивировании ЭК на дцВКМ менее выражены на первичных клетках. Результаты анализа протеома кондиционированной среды с помощью масс-спектрометрии указывают на то, что GDF11 может положительно регулировать синтез митогенов и их активаторов. Потенциально, это может обуславливать способность GDF11 влиять на регенерацию тканей.