Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В первый год выполнения Проекта на экспериментальной токсической модели нейродегенерации, вызванной хлоридом триметилолова «ТМТ» оценивали и сравнивали влияние на структурно-функциональные изменения в гиппокампе и префронтальной коре мозга крыс: 1) блокаду NMDA рецепторов глутамата посредством Мемантина. Группа «ТМТ+МЕМ»; 2) комбинированную терапию с помощью блокады NMDA рецепторов глутамата посредством Мемантина и применением: а) агониста Группы II метаботропных рецепторов глутамата LY379268. Группа «ТМТ+МЕМ+ LY»; б) положительного аллостерического модулятора Группы III метаботропных рецепторов глутамата VU0422288. Группа «ТМТ+МЕМ+ VU»; в) положительного аллостерического модулятора метаботропных рецепторов глутамата подтипа 4 -TCN 238. «ТМТ+МЕМ+ ТСN»; Исследование когнитивных функций в программно-аппаратном комплексе «Шелтер» во время трех кратного привыкания к установке выявили отличия между группами по показателям вертикальной активности (груминг и подъем на задние лапы) и предпочтении животных темного/светлого отсека установки, результаты могут указывать на степень тревожности и исследовательской активности животных. Так, животные групп «ТМТ+МЕМ+VU» и «ТМТ» были более тревожными. Наоборот, животные групп «ТМТ+МЕМ» проявляли повышенную исследовательскую активность, а крысы в группе «ТМТ+ME+LY» предпочитали находиться в светлом отсеке дольше, чем животные «Контрольной» и «ТМТ» групп, что может косвенно свидетельствовать об анксиолитическом действии примененной фармакологической комбинации. Результаты тестирования рефлекса пассивного избегания применяли для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа. Наши результаты показали, что наиболее высокий латентный период был у контрольных животных (при их помещении в светлый отсек оставались в нем достоверно дольше, чем крысы всех экспериментальных групп), затем у крыс группы «ТМТ+ME+LY», затем «ТМТ+ME+TCN» и «TMT+ME+VU», самый низкий у животных «ТМТ+МЕМ» и «ТМТ». Так, дефицит долговременной памяти у животных группы «ТМТ» и «ТМТ+МЕМ», был значительнее, чем у животных группы «ТМТ+ME+LY», «ТМТ+ME+TCN» и «TMT+ME+VU». Были проведены морфологические исследования гиппокампа и префронтальной области коры мозга, данные структуры тесно связанны с когнитивными функциями, кроме того, известно, что они уязвимы при заболеваниях, сопровождающихся деменцией. Результаты окраски тонких срезов по Нисслю и морфологическая оценка сохранности нейронов выявили, что в гиппокампе поле СА3 менее уязвимо, чем СА4 гиппокампа. Было выявлено достоверно отличие плотности нейронов СА4 и СА3 полей гиппокампа у крыс контрольной группы от плотности нейронов у всех подопытных групп животных. Дегенерация нейронов в гиппокампе была выявлена у крыс всех подопытных групп, но в разной степени. Наиболее нейропротекторным действием среди исследуемых фармакологических агентов обладает комбинация мемантина применяемого совместно с VU0422288, затем комбинация мемантина и LY379268, наименее эффективным оказалась терапия с применением только мемантина и комбинация мемантина и TCN238. Исходя из гетерогенности префронтальной коры, для подсчета пикнотических клеток нами была выбрана прелимбическая область, т.к. ей приписывают участие в сложных поведенческих комплексах, включая избирательность внимания, мониторинг поступающей информации, ингибирование нерелевантных поведенческих реакций, переключение между задачами, планирование и принятие решений, а ее удаление приводит к нарушениям условнорефлекторной реакции страха. Результаты подсчета пикнотических клеток в прелимбической области префронтальной коры выявили тенденцию к их увеличению в группе животных «ТМТ» и «ТМТ+МЕМ», хотя достоверных различий между группами выявлено не было. Таким образом, на основании результатов, полученных в первый год, можно сделать заключение, что наиболее эффективными нейропротекторными свойствами обладает комбинированная терапия с применением агентов: 1) неконкурентный антагонист NMDA рецепторов Memantine hydrochloride (мемантин) в дозе 10 мг/кг через 48 и 72 часа после инъекции ТМТ совместно с агонистом Группы II метаботропных рецепторов глутамата LY379268 в дозе 1 мг/кг, в/б через 5, 6, 7, 8 суток после инъекции ТМТ; 2) неконкурентный антагонист NMDA рецепторов Memantine hydrochloride (мемантин) в дозе 10 мг/кг через 48 и 72 часа после инъекции ТМТ совместно с положительным аллостерическим модулятором Группы III метаботропных рецепторов глутамата VU0422288 в дозе 3мг/кг, в/б через 5, 6, 7 суток после инъекции ТМТ. Данные выбранные подходы фармакокоррекции уменьшили проявление нейротоксического повреждения мозга по поведенческим и морфологическим показателям.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Во второй год выполнения Проекта на экспериментальной токсической модели нейродегенерации, вызванной хлоридом триметилолова (ТМТ) оценивали влияние на структурно-функциональные изменения в гиппокампе и префронтальной коре мозга крыс: 1) блокады NMDA рецепторов глутамата посредством Мемантина. Группа (ТМТ+МЕМ); 2) активации метаботропных рецепторов глутамата группы III. Группа (TMT+VU0422288) 3) активации метаботропных рецепторов глутамата группы II. Группа (ТМТ+ LY379268) 4) комбинированной терапии с помощью блокады NMDA рецепторов глутамата посредством Мемантина и применением: а) положительного аллостерического модулятора Группы III метаботропных рецепторов глутамата VU0422288. Группа (ТМТ+МЕМ+ VU); б) агониста Группы II метаботропных рецепторов глутамата LY379268. Группа «ТМТ+МЕМ+ LY»; Были проведены морфологические исследования гиппокампа и префронтальной методом окраски срезов мозга по Нисслю. Морфометрия нейронов в гиппокампе показывает, что у всех экспериментальных групп была наиболее выраженная деградация нейронов пирамидных слоев в полях СА4 и СА3 гиппокампа по сравнению с контролем. В то же время нейроны поля СА2 были наименее уязвимы к токсическому действию ТМТ и не обнаружили существенных различий между контрольной и подопытными группами животных. Результаты, полученные при подсчете нейронов поля СА1 гиппокампа показали, что у животных групп «ТМТ» и «ТМТ+VU» «ТМТ+MEM+LY» и «TMT+LY» плотность клеток значительно ниже, чем у контрольных животных. Плотность нейронов у животных групп «ТМТ+МЕМ» и «ТМТ+МЕМ+VU» не отличались от контроля. Из полученных результатов следует, что совместное введение мемантина и VU0422288 наиболее эффективно сохраняет нейроны в области CA1 гиппокампа от нейротоксического повреждения ТМТ.Результаты исследований прелимбической области префронтальной коры показали, что наиболее часто пикнотические клетки встречаются в более глубоких 4-5м слоях. Подсчет пикнотических клеток не выявил достоверных различий между контрольной и подопытными группами через 21 день после ТМТ. Полученные результаты позволяют сделать заключение, что префронтальная кора является более устойчивой к нейротоксическому повреждению структурой, чем гиппокамп. Результаты ультраструктурных исследований гиппокампа и префронтальной коры крыс после их повреждения ТМТ через 7, 30 и 50 дней после воздействия показали, что в обеих структурах мозга наблюдались повреждения нейронов. В гиппокампе через 7 суток после интоксикации было отмечено появление большого числа аутофагосом (АФ, 0.9±0.1 на мкм2) в соме нейронов, дендритах и аксонах. Кроме того, наблюдалось появление гиперхромных нейронов, нарушение структуры митохондрий. В префронтальной коре поврежденные нейроны также содержали АФ, однако их число было значительно меньше – 0,3±0,1 на мкм2. Число АФ по мере увеличения срока после введения ТМТ снижалось: через 30 суток после инъекции в гиппокампе оно составляло 0,1± 0,01на мкм2, а в префронтальной коре АФ уже не встречались. Таким образом, в гиппокампе аутофагия, по-видимому, оказалась недостаточно эффективной, чтобы предотвратить гибель нейронов, вызванную нейротоксикантом. Результаты тестирования когнитивных функций указывает, что повреждение нейронов гиппокампа привело к поведенческим нарушениям, что отразилась на памяти животных. Рефлекс пассивного избегания – является одним из базисных при оценке влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа. Согласно полученным результатам, память у всех подопытных животных нарушалась, и в наибольшей степени в группе «ТМТ» и «TMT+LY». Отметим, что группа животных с введением «TMT+МЕМ+VU» «TMT+МЕМ+LY» «TMT+VU» показала некоторое улучшение воспроизведения реакции, хотя и незначительное. Результаты изучения экспрессии генов методом ОТ-ПЦР в реальном времени показали, что ТМТ и последующая фармакологическая модуляция не оказывали существенного влияния на уровень мРНК генов, характеризующих глутаматергическую синаптическую передачу в гиппокампе через 21 день после ТМТ. Так, уровень экспрессии мРНК EAAT2, кодирующего глиальный переносчик глутамата, осуществляющего 90% его обратного захвата, а также субъединиц НМДА рецепторов Grin2B и субъединиц АМПА рецепторов Gria1 были близки к контрольным значениям. Исключением явилось снижение уровня экспрессии Grin2B и Gria1 у животных Группы «ТМТ+VU». Кроме того, мы исследовали экспрессию генов, вовлеченных в нейровоспаление. Уровень экспрессии гена Aif, кодирующего белок IBA1, признанного маркера микроглии достоверно повышался в группах «TMT+VU» и «TMT+LY» относительно контроля. Уровень мРНК Il1b, кодирующего один из провоспалительных цитокинов ИЛ1-бета, был повышен в гиппокампе животных всех экспериментальных групп по сравнению с контролем, кроме группы «TMT+MEM+VU», в которой уровень не отличался от контрольного. Экспрессия гена Gfap, кодирующего одноименный белок и признанный маркер астроцитов повышался в три и более раз относительно контроля в подгруппах «ТМТ» и «TMT+VU» и «TMT+MEM», но не в подгруппе «TMT+MEM +VU» и «TMT+MEM +LY». Уровень TGFb1, кодирующего один из противовоспалительных цитокинов трансформирующего фактора роста бета1 наиболее всего был повышен по сравнению с контролем в подгруппе «TMT+VU», а также в подгруппах «TMT+MEM» и «ТМТ», но не у животных группы «TMT+MEM+VU». Таким образом, вместе взятые данные анализа экспрессии генов указывают на то, что в гиппокампе животных всех экспериментальных групп, кроме «TMT+MEM+VU» наблюдается нейровоспаление. Результаты иммуногистохимического окрашивания показали, что клетки микроглии у животных контрольной группы упорядочены и имеют разветвленный фенотип с компактными телами клеток и удлиненными отростками. Тогда как, в подопытных группах «ТМТ», «TMT+MEM», «TMT+VU», «TMT+MEM+VU» мы наблюдали увеличение количества активированных амебовидных клеток микроглии с утолщенными отростками преимущественно в хилусе и СА4-СА3 полях гиппокампа, а также палочковидную микроглию в пирамидном слое СА1 гиппокампа. Результат подсчета IBA1- позитивных клеток показал, что плотность числа клеток микроглии в хилусе достоверно выше в подгруппах «TMT» и «TMT+MEM» по сравнению с контрольной группой, тогда как в пирамидном слое СА1 не было выявлено достоверных отличий между группами. Площадь занимаемая IBA1- позитивными клетоками в хилусе гиппокампа в группе «ТМТ» была достоверно больше, чем в контроле, в то время как в пирамидном поле СА1 по площади достоверных различий между группами выявлено не было. Для анализа формы микроглии мы использовали показатель Feret aspect ratio>2, который оценивает вытянутость клеток микроглии, характерную для ее палочковидного фенотипа. Результаты не выявили отличий по данному показателю в хилусе, однако в области СА1 вытянутых клеток было больше относительно контроля во всех подопытных подгруппах «ТМТ», «ТМТ+МЕМ» и «ТМТ+VU» кроме «ТМТ+МЕМ+VU». Анализ результатов GFAP позитивных клеток по показателям количества и занимаемой площади не выявил достоверных различий между группами животных как в хилусе, так и в поле СА1. Полученные в настоящей работе результаты подтверждают гипотезу о том, что контроль глутаматной эксайтотоксичности оказывает влияние на протекание нейровоспаления. В наших экспериментальных условиях кратковременная модуляция глутаматергической синаптической передачи оказала влияние на нейровоспаление, хотя его полного разрешения и не произошло. Выявлено повышение эффективности совместного применения антагониста НМДА рецепторов (мемантин) и позитивной аллостерической модуляции метаботропных рецепторов Группы III (VU0422288) в отношении гибели нейронов, по сравнению с применением этих веществ в отдельности. Этот результат, по-видимому, обусловлен тем, что вещества нацелены как на пре-, так и постсинаптические процессы глутаматной нейропередачи.