Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Было сконструировано четыре лентивирусных вектора: 1. QtEnc_QtIMEF-FLAG – несет генетическую последовательность, кодирующую белки оболочки нанокомпартмента Quasibacillus thermotolerans (диаметр оболочки 42 нм, на оболочке имеется FLAG-tag) и грузовой белок IMEF - фермент, окисляющий двухвалентное железо. 2. MxEncA-FLAG - несет генетическую последовательность, кодирующую белки оболочки нанокомпартмента Myxococcus Xantus (диаметр оболочки 31 нм, на оболочке имеется FLAG-tag). 3. PAmCherry-MxSig - несет генетическую последовательность, кодирующую флуоресцентный белок – фотоактивируемую форму флуоресцентного белка mCherry. 4. mZip14 - транспортер двухвалентных металлов, для улучшения транспорта железа в клетки. Для получения трансгенных клеточных линий, продуцирующих инкапсулиновые системы, вирусы используются попарно: вектор QtEncFLAG_QtIMEF совместно с mZip14., вектор, кодирующий MxEncA-FLAG, используется в сочетании с PAmCherry-MxSig. Плазмидные ДНК для сборки лентивирусов нарабатывали по стандартной методике в компетентных бактериях NEB Stable Competent E. coli. Лентивирусы получали путем реагентной ко-трансфекции с использованием упаковочной линии клеток Phoenix. Для каждого из полученных векторов титр составил не менее 2*10 6. После наработки вирусы были заморожены в парах жидкого азота. Получение клеточных линий млекопитающих со стабильной экспрессией генов инкапсулиновых систем было осуществлено методом лентивирусной трансдукции по стандартному протоколу с использованием полибрена (Sigma‐Aldrich) в концентрации 8 μг/мл. Клетки-продуценты нанокомпартментов с магнитным содержимым получали методом селекции на антибиотике (пуромицин в концентрации 3 мкг/мл с последующим повышением до 5 мкг/мл) с последующей селекцией с использованием препарата железа (сульфат аммония железа (ferrous ammonium sulfate, FAS)) в концентрации 1-2 мМ. В качестве оптимальной линии-продуцента нанокомпартментов с магнитным содержимым нами была выбрана линия HT-1080-Qt. Для клеток были проведены ПЦР исследование, окраска Прусским синим, выявившая накопление депозитов железа в клетках, определение жизнеспособности полученных клеток в присутствии различных концентраций FAS, а также определение времени Т2-релаксации. Согласно данным МРТ, время релаксации Т2 для клеток HT-1080-Qt после инкубации с FAS в концентрации 1 мМ в течение 24 часов было существенно ниже, чем в интактных HT-1080, а также в HT-1080 после инкубации с FAS в такой же концентрации. Нанокомпартементы были выделены из клеток методом иммунопреципитации. Благодаря содержанию электронноплотных частиц оксида железа внутри оболочек нанокомпартментов, возможна их визуализация методом трансмиссонной электронной микроскопии, было показано, что диаметр наночастиц в выделенных нанокомпартментах составляет 23.6 ± 6 нм. В качестве линии-продуцента с нанокомпартментов с флуоресцентным содержимым были выбраны клетки 293Т-EncA-PAmCherry. Фотоактивация инкапсулированной метки была исследована методом лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Было определено минимально необходимое время фотоактивации метки, составившее 5 секунд. Максимальная интенсивность флуоресценции инкапсулированного PAmCherry наблюдалась после фотоактивации метки в течение 30 секунд. Было показано, что в фиксированных клетках фотоконверсия не происходит. Результаты работы были оформлены в виде статьи, статья опубликована в журнале Nanomaterials..

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
- Железосодержащие наночастицы, образующиеся внутри оболочек инкапсулинов Qt, были детектированы при помощи просвечивающей электронной микроскопии. Был определен средний размер этих наночастиц, составивший 23,6 ± 6 нм. - Методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии был исследован процесс фотоактивации грузового белка PAmCherry в нанокомпартментах Mx, а также определено минимальное время фотоактивации, составившее 5 с. Было установлено, что инкапсуляция PAmCherry не нарушает процесса фотоактивации. Кроме того, было показано, что белковая оболочка нанокомпартмента Mx защищает грузовой белок PAmCherry от действия внутриклеточных ферментов и позволяет визуализировать флуорсцентный сигнал в течение, как минимум, 2 часов после интернализации нанокомпартментов в клетки. - Методом атомно-эмиссионной спектрометрии было показано, что концентрация внутриклеточного железа в клетках, содержащих нанокомпартменты Qt, практически на порядок выше, по сравнению с интактными клетками, после 24 часов инкубации с FAS. Кроме того, было установлено, что выживаемость клеток, содержащих нанокомпартменты, в присутствии FAS в ростовой среде статистически достоверно выше, по сравнению с выживаемостью интактных клеток. - Нанокомпартменты Qt и Mx были изолированы из клеток-продуцентов методом иммунопреципитации. Методом ДСР были измерены гидродинамические размеры выделенных нанокомпартментов, составившие 44 ± 2 нм и 37 ± 6 нм, соответственно. - Изолированные нанокомпартменты Qt и Mx были функционализированны посредством конъюгации молекул апотрансферрина на оболочках, было получено две векторных наноконтейнерных системы Qt-Tf-FAM и Mx-Tf-FAM. - Для подтверждения векторности полученных наноконтейнерных систем была проведена сравнительная оценка захвата нанокомпартментов Qt-Tf-FAM и Mx-Tf-FAM клетками линии U87 и hADMSCs (высокий и низкий уровень экспрессии трансферринового рецептора 2 типа, соответственно). Методом конфокальной микроскопии было установлено, что нанокомпартменты Mx-Tf-FAM с флуоресцентным грузовым белком PAmCherry захватываются клетками U87 существенно лучше, по сравнению с hADMSCs при одном и том же времени инкубации нанокомпартментов с клетками. Для нанокомпартментов Qt-Tf-FAM была проведена качественная и количественная оценка накопления железа в клетках U87 и hADMSCs, методом окраски Прусским синим и АЭС, соответственно. Окраска Прусским синим показала наличие характерной синей окраски цитоплазмы в клетках линии U87, что свидетельствует о накоплении железа. В hADMSCs подобной окраски обнаружено не было. Эти данные были подтверждены методом АЭС, количество внутриклеточного железа составило 16 ± 0,6 пг/клетку и 0,4 ± 0,2 пг/клетку для U87 и hADMSCs, соответственно. Полученные данные свидетельствуют об адресности разработанных нами наноконтейнерных систем и о возможности их потенциального использования в качестве платформы для терапии мультиформной глиобластомы человека. - Была опубликована статья в журнале International Journal of Molecular Sciences, а также обзор в журнале Биохимия.