КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 21-75-00014

НазваниеПоиск новых молекулярных мишеней в терапии первичных злокачественных опухолей костей

РуководительГалембикова Айгуль Рафиковна, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Республика Татарстан (Татарстан)

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2021 - 06.2023

Конкурс№60 - Конкурс 2021 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-208 - Онкология

Ключевые словаостеосаркома, саркома Юинга, ингибиторы рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ, резистентность, химиотерапия, репарация повреждений ДНК, апоптоз, сенситизация.

Код ГРНТИ76.29.49

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Саркомы мягких тканей (СМТ) и первичные злокачественные опухоли костей относятся к мезенхимальным опухолям. Остеосаркома является наиболее часто встречающейся первичной злокачественной опухолью костной ткани (35%), на втором месте стоит саркома Юинга, в то время как остальные гистологические формы встречаются достаточно редко. Несмотря на то, что первичные злокачественные опухоли костей встречаются довольно редко, данные новообразования характеризуются крайне агрессивным характером течения и плохим прогнозом вследствие быстрого инвазионного роста и частых послеоперационных осложнений (метастазы и рецидивы). Для пациентов с рецидивирующими и метастатическими формами заболевания возможности нехирургических методов лечения остаются весьма ограниченными. Это обусловлено множеством факторов, среди которых следует выделить генетическую и гистологическую гетерогенность как первичных новообразований, так и очагов метастатических поражений, а также отсутствием молекулярных мишеней, что существенным образом ограничивает использование имеющихся в арсенале врачей-онкологов таргетных препаратов. В настоящее время основным методом лечения остеосаркомы и саркомы Юинга является неоадъювантная химиотерапия с последующей хирургической резекцией и адъювантной химиотерапией. Лучевая терапия менее эффективна и применяется редко (в основном при саркоме Юинга). Однако полихимиотерапия часто сопровождается побочными эффектами вследствие системных резорбтивных эффектов (кардио-, нефро-, гепатотоксичность, угнетение гемопоэза и иммунной системы) и редко приводит к полной ремиссии заболевания. Известно, что 5-летняя выживаемость пациентов с метастатическими формами остеосаркомы или саркомы Юинга составляет не более 20-30%, что существенно ниже по сравнению с пациентами с локализованной формой заболевания(70-80%). В настоящее время известно несколько таргетных препаратов, дающие редкие объективные ответы у пациентов с метастатическими формами остеосарком. К ним относятся, в первую очередь, сорафениб, используемый в качестве монотерапии или в сочетании с эверолимусом, а также регорафениб. Тем не менее, несмотря на изначальную эффективность данной терапии, периоды ремиссии у пациентов с данными формами злокачественных новообразований являются непродолжительными (не более 6 месяцев), а случаи излечения не описаны. Известно, что химиотерапия направлена на образование повреждений ДНК и индукцию апоптоза, а таргетная терапия – на блокаду мишени, гиперэкспрессированной в том или другом новообразовании. Также является очевидным, что успех химиотерапии будет зависеть от эффективности репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках, а эффективность таргетной терапии – от наличия той или другой молекулярной мишени, а также от степени гетерогенности опухоли, т. е. от соотношения "мишень-положительных" клеток к опухолевой массе. Так же известно, что некоторые таргетные препараты, являющиеся ингибиторами рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ, влияют на эффективность репарации повреждений ДНК. В связи с вышеизложенным, является актуальным изучение молекулярных механизмов действия таргетных препаратов на процессы репарации повреждений ДНК. Это, в свою очередь, позволит выявить новые молекулярные мишени для изучение эффективности комбинированного использования химио- и таргетных препаратов, что, на наш взгляд, приведет к сенситизации опухоли к используемым в настоящее время химиопрепаратам и существенным образом повысит эффективность проводимой химиотерапии. Одной из задач научного проекта будет являться изучение функционального состояния систем репарации повреждений ДНК в клетках остеосарком и саркомы Юинга. Для решения данной задачи будут использованы тесты по оценке функциональной активности систем репарации повреждений ДНК в клетках остеосарком и саркомы Юинга – сравнительный анализ экспрессии белков репарации до и после индукции повреждений ДНК, тест ДНК-комет, проточная цитометрия с использвоанием репортерных GFР-содержащих конструкций и др. Будут получены клеточные суб-линии остеосарком и саркомы Юинга, стабильно экспрессирующих оригинальные репортерные конструкции, которые будут содержать сайты для образования двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. На данных клеточных линиях будет проведена оценка способности таргетных препаратов влиять (предположительно ингибировать) процессы репарации ДНР ДНК. Успешное выполнение данной научной задачи приведет к обнаружению в клетках остеосарком и саркомы Юинга молекулярных дефектов в системах репарации повреждений ДНК, что в дальнейшем позволит разработать прицельную терапию, направленную на индукцию летальных (т.н. нерепарируемых) повреждений ДНК. Также при выполнении данной задачи будут проведены исследования по выявлению взаимосвязи между химиочувствительностью и функциональной активностью белка-онкосупрессора р53. В связи с тем, что до настоящего времени не обнаружено сигнальных путей, определяющих пролиферативный потенциал клеток остеосарком и саркомы Юинга, одной из научных задач данного проекта будет являться обнаружение признаков активации сигнальных путей, играющих роль в пролиферации опухолевых клеток. Использование селективных ингибиторов, а также киРНК к выявленным сигнальным путям, позволит идентифицировать в клетках остеосарком и саркомы Юинга мишени для последующей разработки таргетной терапии больных с данными заболеваниями, которых в настоящее время в арсенале врачей-онкологов не имеется. На заключительном этапе данного проекта будут получены данные о способности таргетных препаратов влиять на репарацию повреждений ДНК. Это, в свою очередь, создаст предпосылки для их клинического применения в сочетании с химиопрепаратами с целью усиления цитотоксического эффекта последних и снижения частоты рецидивов остеосарком и саркомы Юинга.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения научного проекта будут выявлены клеточные факторы, которые играют определяющую роль в обеспечении выживаемости и пролиферации клеток остеосарком и саркомы Юинга, и, соответственно, в чувствительности/резистентности к воздействию химиопрепаратов. Данные клеточные факторы в дальнейшем могут являться молекулярными мишенями для таргетного воздействия в терапии пациентов с остеосаркомой и саркомой Юинга. Решение научной задачи №1 подразумевает выявление в опухолевых клетках остеосарком и саркомы Юинга факторов репарации повреждений ДНК, направленное воздействие на которые будет повышать эффективность проводимой химиотерапии пациентам с различными формами остеосарком и саркомы Юинга. Для выполнения данной научной задачи будут использованы клеточные линии первичных злокачественных опухолей костей (остеосаркомы, саркомы Юинга и фибросаркомы). Для объективной оценки получаемых результатов планируется использовать также нетрансформированные фибробласты человека. Методами вестерн-блоттинга, иммуногистохимического окрашивания и ПЦР в реальном времени будет изучен уровень экспрессия белков, участвующих в репарации повреждений ДНК. Комплексный анализ уровня экспрессии белков-репарантов повреждений ДНК в исследуемых клетках позволит обнаружить достоверные различия между нетрансформированными и опухолевыми клетками. На основании полученных результатов будет сделан анализ взаимосвязи имеющихся дефектов системы репарации повреждений ДНК в данных опухолевых клетках с химиорезистентностью. Для подтверждения различий в уровнях экспрессии белков-репарантов повреждений ДНК между чувствительными и резистентными к химиопрепаратам клетками остеосарком и саркомы Юинга будут выведены экспериментальные сублинии клеток с генотипическими и фенотипическими признаками химиорезистентности (например, доксорубицину, ифосфамиду). Исходя из накопленного опыта по получению резистентных к химиопрепаратам сублиний опухолевых клеток различной природы, вероятность успешного решения данной научной задачи следует считать высокой. После этого, будет проведен сравнительный анализ уровней экспрессии белков репарации повреждений ДНК между “материнскими” (чувствительными к доксорубицину) и “дочерними” (т.е. резистентными к доксорубицину, ифосфамиду) сублиниями клеток остеосарком и сарком Юинга. Мы ожидаем, что полученные результаты об изменении уровня экспрессии определенных белков, участвующих в репарации повреждений ДНК в исследуемых клетках будут коррелировать с их химиорезистентностью. К этому времени мы ожидаем получить результаты скрининга опухолевых клеточных линий первичных злокачественных опухолей костей и нетрансформированных клеток (контроль) на предмет их чувствительности к действию химиопрепаратов с различным механизмом действия (ингибиторы ДНК-топоизомеразы II типа, таксаны, винкоалкалоиды, препараты платины, алкилирующие агенты и др.). При проведении скрининга будут вычислены половинные ингибирующие дозы (IC50) с помощью колориметрического MTS-теста. На основании результатов будет проведен корреляционный анализ между обнаруженными дефектами в уровнях экспрессии белков репарации повреждений ДНК в клетках остеосарком и саркомы Юинга и их химиочувствительностью. Таким образом, мы ожидаем получить доказательства о потенциальной взаимосвязи между нарушениями в уровне экспрессии определенных белков-репарантов повреждений ДНК в клетках остеосарком и саркомы Юинга и их чувствительностью к определенным группам противоопухолевых препаратов. Для подтверждения полученных результатов в последующем будут проведены исследования по изучению способности опухолевых клеток репарировать повреждения ДНК, индуцируемые химиопрепаратами. Также при выполнении данной задачи будет проведена работа по выявлению связи между химиочувствительностью и статусом онко-супрессора р53. Выбор химиопрепаратов и клеточных линий первичных злокачественных опухолей костей будет основан на результатах ранее проведенного скрининга по оценке химиочувствительности данных клеток. Для решения этой научной задачи также будет использован широкий спектр традиционных методов (иммуноблоттинг и иммунофлюоресцентный анализ для динамической оценки уровня экспрессии и фокального распределения фосфорилированной формы гистона 2А по остаткам серина в положении 139; тест ДНК-комет и др.). К тому же будет использован оригинальный метод оценки эффективности репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК в опухолевых клетках, стабильно экспрессирующих репортерные (GFP-содержащие) конструкции. Данные суб-линии позволят проводить качественную и количественную оценку эффективности процессов гомологичной рекомбинации и негомологичного связывания концов ДНК (см. подробнее в разделе “План научных исследований первого года”). На основании обнаруженных в опухолевых клетках остеосарком и саркомы Юинга дефектов в различных путях репарации повреждений ДНК, будут проведены исследования по селективному “выключению” (киРНК) или ингибированию активности (селективные ингибиторы) факторов репарации повреждений ДНК. После чего планируется провести оценку их жизнеспособности под влиянием генотоксического воздействия определенных групп химиопрепаратов, к которым клетки остеосарком и саркомы Юинга не были чувствительными. Оценка жизнеспособности клеток будет изучен колориметрическим методом (MTS). Для изучения механизмов гибели опухолевых клеток остеосарком и саркомы Юинга в данных экспериментальных условиях будут использованы методы вестерн-блоттинга (для оценки уровней экспрессии расщепленных форм ПАРП, каспазы-3 и др. маркеров апоптоза) и проточной цитофлюорометрии (для подсчета количеств Annexin V-, TUNEL-положительных и гиподиплоидных клеток). Таким образом, в результате реализации задачи №1 будут выявлены наиболее эффективные химиопрепараты, ингибирующие пролиферацию и жизнеспособность клеток остеосарком и саркомы Юинга in vitro и функциональные дефекты в системах репарации повреждений ДНК в этих клетках, способные определять их чувствительность/резистентность к химиопрепаратам определенных групп. Решение научной задачи № 2 подразумевает выявлению новых киназ в опухолевых клетках остеосарком и сарком Юинга, которые определяют их высокую пролиферативную активность и жизнеспособность. Для получения данных об активации различных типов киназ в опухолевых клетках остеосарком и саркомы Юинга будут использованы коммерческие наборы на основе мАТ (Cell Signaling; ProteomeProfiler), и мРНК (SABiosciences). Комплексный подход в решении данной науно-исследовательской задачи позволит выделить 20-40 разновидностей киназ, у которых будут выявлены признаки активации. В последующем будут изучены механизмы влияния данных киназ на жизнеспособность и пролиферативный потенциал опухолевых клеток остеосарком и саркомы Юинга с помощью соответствующих киРНК. Жизнеспособность и пролиферацию клеток остеосарком и сарком Юинга будут изучены с помощью колориметрического метода (MTS) и проточной цитометрии. Следующим этапом будет являться подбор ингибиторов к данным киназам (вестерн-блоттинг) для определения уровня подавления их активности соответствующими ингибиторами. В результате реализации задачи №3 мы ожидаем получить доказательства о возможности сенситизации клеток остеосарком и саркомы Юинга к химиопрепаратам, традиционно используемым в лечении больных с данной патологией (доксорубицину и ифосфамиду) на фоне выключения активности киназ, играющих роль в жизнеспособности клеток остеосарком и сарком Юинга. Также в рамках решения данной задачи будет проведена оценка эффективности процессов репарации ДНР ДНК под влиянием таргетных препаратов (ингибиторы рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ – иматиниб, сунитиниб, регорафениб, кабозантиниб, кризотиниб, BGJ398, PD173074, руксолитиниб, МК2206, U0126 и др.). После выявления способности определенных таргетных препаратов ингибировать процессы репарации ДНР ДНК в клетках остеосарком и саркомы Юинга планируется изучение способности данных препаратов повышать чувствительность данных клеток к химиопрепаратам определенных групп (ингибиторы ДНК-топоизомеразы II типа). Таким образом, мы полагаем, что успешное решение научных задач № 2 и 3 приведет к выявлению новых молекулярных мишеней (киназ) в клетках остеосарком и сарком Юинга, селективное воздействие на которые будет приводить к гибели клеток остеосарком и сарком Юинга, и/или будет сенситизировать их к уже имеющимся химиопрепаратам. Комплексный и подробно спланированный подход в выполнении научного проекта позволяет рассчитывать на достижение положительного результата в реализации всего проекта в целом.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В результате проведенных исследований за первый год были получены данные о состоянии систем репарации повреждений ДНК в клетках остеосарком, саркомы Юинга и фибросаркомы. В частности, было обнаружено повышение уровня экспрессии О6-метилгуанин ДНК-метилтрансферазы (MGMT) практически во всех клеточных линиях остеосарком и саркомы Юинга, что может являться одним из факторов их резистентности к алкилирующим агентам (в частности, ифосфамиду и темозоломиду). В свою очередь клеточная линия остеосаркомы HOS и фибросаркомы HT1080 не экспрессировали MGMT, что может обуславливать их чувствительность к ифосфамиду и другим химиопрепаратам из данной группы. Увеличении уровня экспрессии XRCC1, принимающего участие в эксцизионной репарации оснований, в опухолевых клеточных линиях (кроме HOS) также может обуславливать устойчивость опухолевых клеток к алкилирующим препаратам и лучевой терапии. В свою очередь, гиперэкспрессии фермента ERCC1, играющих ключевую роль в вырезании повреждённых нуклеотидов, может служить маркером резистентности к препаратам платины и ионизирующему излучению. Важной находкой при изучении репарационного профиля у всех исследованных клеточных линий остеосарком, саркомы Юинга и фибросаркомы явилось повышение уровня экспрессии топоизомеразы IIа типа. Этот факт может определять чувствительность данных клеток к действию химиопрепаратов, относящихся к классу ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа, а именно, доксорубицину и этопозиду. На основании полученных результатов были проведены исследования по изучению чувствительности клеток остеосарком и саркомы Юинга к химиопрепаратам отдельных групп: ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа (доксорубицину, этопозиду), к алкилирующим агентам (ифосфамиду и темозоламиду) и митотическим ядам (паклитакселу и винбластину). Как и ожидалось (согласно предварительному анализу состояния системы репарации повреждений ДНК в исследуемых клеточных линиях), клетки остеосарком и саркомы Юинга были чувствительны к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа, а также к митотическим ядам, и более устойчивы к алкилирующим агентам. На следующем этапе исследования были идентифицированы в клетках остеосарком, саркомы Юинга и фибрасаркомы признаки активации киназ-опосредованных сигнальных путей, регулирующих процессы пролиферации, деления и апоптоза. Методом вестерн-блоттинга было обнаружено, что уровень экспрессии фосфорилированных форм c-Met, FGFR, Akt, MAPK киназ положительно коррелировал с синергизмом действия доксорубицина и селективными ингибиторами соответствующих киназ - c-Met, FGFR, Akt и MAPK. Результаты вестерн-блоттинга также коррелировали с результатами МТS-теста и проточной цитофлюорометрии по подсчету количеств клеток, погибающих по механизму апоптоза. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ингибирование ключевых для выживаемости опухолевой клетки киназ-опосредованных путей, в частности, Akt-сигнального пути, эффективно сенсибилизирует клетки остеосарком, саркомы Юинга и фибросаркомы к ингибитору ДНК-топоизомеразы II типа, доксорубицину (Бойчук С. В., Дунаев П. Д., Галембикова А. Р. Ингибирование AKT-сигнального пути в саркомах мягких тканей — новый подход к их сенситизации к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа // Клиническая патофизиология. 2021. Т. 27, № 3. С. 75–87). В рамках первого года исследований также велась работа по получению сублиний остеосарком U2OS и Saos-2 и саркомы Юинга А673, обладающих фенотипическими признаками резистентности к химиопрепаратам (к доксорубицину и ифосфомиду). Данные клеточные линии были культивированы в присутствии постепенно-увеличивающихся доз препарата (доксорубицина или ифосфамида) в течение 1-5 месяцев (10-40 пассажей). Для подтверждения резистентности суб-линий к химиопрепаратам были проведены тесты (МТS) для вычисления значений IC50 в отношении доксорубицина/ифосфомида (и химиопрепаратов других групп – этопозид, паклитаксел и винбластин), а также сравнительный анализ полученных значений с “материнскими” клетками той же линии. Механизм химиорезистентности дочерних сублиний был обусловлен приобретением данными клетками феномена множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Это было подтверждено методом вестерн-блоттинга, который позволил обнаружить гиперэкспрессию маркеров МЛУ (MDR-1, MRP-1, ABCG-2), а также резистентности к доксорубицину (низкий уровень экспрессии топоизомеразы IIа типа) в дочерних сублиниях.

Публикации

1. Бойчук С.В., Дунаев П.Д., Галембикова А.Р. ИНГИБИРОВАНИЕ AKT-СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В САРКОМАХ МЯГКИХ ТКАНЕЙ — НОВЫЙ ПОДХОД К ИХ СЕНСИТИЗАЦИИ К ИНГИБИТОРАМ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫ II ТИПА КЛИНИЧЕСКАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ, Том 27, № 3. 2021 (год публикации - 2021)

2. Галембикова А.Р., Бикиниева Ф.Ф., Бойчук С.В. MK2206, an AKT-inhibitor, sensitizes osteosarcoma cell lines to topoisomerase II inhibitors European journal of clinical investigation, Vol.51, Suppl. 1. – P. 142 (55ASM-0023FT) (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1111/eci.13567

3. Галембикова А.Р., Бойчук С.В. Inhibition of AKT-signalling sensitizes A673 Ewing sarcoma cell line to doxorubicin Annals of Oncology, Vol. 32, Suppl. 6. – P. S1364-S1365 (63P). (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.annonc.2021.08.2059

4. Галембикова А.Р., Бойчук С.В. Tyrosine kinase signaling profile in osteosarcomas: A potential therapeutic target for sensitization to doxorubicin Annals of Oncology, Vol. 32, Suppl. 6. – P. S1365 (64P). (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.annonc.2021.08.2060

5. С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова, Ф.Ф. Бикиниева MK2206 – ингибитор AKT-сигнального пути, сенсибилизирует клеточные линии остеосаркомы к ингибитору ДНК-топоизомеразы II типа Успехи молекулярной онкологии, №6, Том 8, 2021, с.118 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.17650/2313-805X-2021-8-4-5-163

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Результаты скрининговых исследований на предмет оценки чувствительности к химиопрепаратам (ХП) клеток остеосарком (ОС), саркомы Юинга к химиопрепаратам различных групп коррелировали между обнаруженными нами дефектами в уровнях экспрессии белков репарации повреждений ДНК в клетках ОС, саркомы Юинга. Например, во всех клеточных линиях остеосарком (кроме HOS) и саркомы Юинга было обнаружено повышение уровня экспрессии О6-метилгуанин ДНК-метилтрансферазы (MGMT), что может обуславливать их устойчивость к алкилирующим агентам. Действительно, эти клеточные линии были малочувствительны даже к высоким дозам ифосфамида и темозоломида. В свою очередь клеточная линия остеосаркомы HOS, фибросаркомы HT1080, а также опухолевые клетки лейомиосаркомы линии SK-LMS-1 не экспрессировали MGMT, что коррелировало с чувствительностью данных кдеток к ифосфамиду и темозоламиду. Следующей находкой при изучении репарационного профиля опухолевых клеток явилось увеличение уровня экспрессии топоизомеразы IIα у большинства исследованных клеточных линий, что коррелировало с высокой чувствительностью клеток ОС и саркомы Юинга к действию химиопрепаратов, относящихся к классу ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа (доксорубицину и этопозиду). Активация различных сигнальных путей, обеспечивающих усиление пролиферации опухолевых клеток и их устойчивость к апоптозу, является довольно частым событием при многих злокачественных новообразованиях, в том числе при остеосаркоме и саркоме Юинга. Тем не менее, несмотря на достаточно убедительные данные, свидетельствующие об активации достаточно широкого спектра тирозинкиназных путей в клетках ОС и саркомы Юинга, доказательств их взаимосвязи с формированием устойчивости данных опухолей к химиопрепаратам до настоящего времени не было получено. В связи с вышеизложенным, представляло интерес изучение зависимости между уровнем экспрессии активированных форм некоторых рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ (c-Met, FGFR, AKT и MAPK) в клетках OС и саркомы Юинга и изменения их чувствительности к ингибитору ДНК-топоизомеразы II типа - доксорубицину на фоне ингибирования активности соответствующих тирозинкиназ с помощью соответствующих ингибиторов. С помощью вестерн-блоттинга идентифицированы в клетках OС, фибросаркомы и саркомы Юинга признаки активации киназ-опосредованных сигнальных путей, регулирующих процессы пролиферации, деления и апоптоза. Методом вестерн-блоттинга было обнаружено, что уровень экспрессии фосфорилированных форм этих киназ положительно коррелировал с синергизмом действия доксорубицина и селективными ингибиторами соответствующих киназ - c-Met, FGFR, Akt и MAPK. С помощью программного обеспечения Synergy Finder были получены двухмерный и трехмерный графики (surface-plots), отражающие оптимальные дозы доксорубицина и МК2206, которые обуславливают наибольший синергизм. Результаты МТТ-теста коррелировали с результатами проточной цитофлюорометрии по подсчету количеств клеток, погибающих по механизму апоптоза (аннексин V-положительных). Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ингибирование AКТ-сигнального пути эффективно сенсибилизирует клетки остеосарком к ингибитору ДНК-топоизомеразы II типа, доксорубицину. Использование ингибиторов нижележащего белка АКТ-сигнального пути — mTOR также повышало чувствительность опухолевых клеток к доксорубицину. Значения Synergy score, свидетельствуют о синергическом действии доксорубицина и ингибиторов mTOR (эверолимуса и рапамицина) в опухолевых клетках. Анализ жизнеспособности и окрашивание кристаллическим фиолетовым подтвердил результаты колориметричеcкого MTS-теста и коррелировал с результатами проточной цитофлуорометрии по подсчету количеств клеток, погибающих по механизму апоптоза. Для выяснения механизмов МК2206-индуцированного повышения чувствительности клеток ОС и саркомы Юинга к доксорубицину были проведены функциональные тесты для определения эффективности путей репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках остеосарком, саркомы Юинга под влиянием МК2206. С этой целью были использованы следующие методические подходы: а) индукция повреждений ДНК (в том числе, двунитевых разрывов) в результате воздействия на клетки доксорубицина и последующая оценка внутриклеточного фокального распределения или перераспределения белков репарации повреждений ДНК с помощью метода иммунофлюоресцентной микроскопии; б) После индукции повреждений ДНК была определена способность клеток к их репарации. С этой целью, после воздействия химиопрепарата (с последующим его отмывом из культуральной среды) с помощью метода ДНК-комет (платформа Сomet Assay IV) был проведен анализ динамики репарации повреждений ДНК (2 часов после воздействия). С этой целью клетки ОС сначала обрабатывали доксорубицином в течение 2 ч, чтобы вызвать повреждение ДНК, затем отмывали ХП и далее культивировали в течение 8 ч в отсутствие или в присутствии MK-2206. Было выявлено существенное увеличение хвоста каметы, тем самым иллюстрируя нерепарируемые повреждения ДНК в опухолевых клетках под влиянием МК2206. Аналогичные данные были получены в клетках, не отмытых от доксорубицина. Как и ожидалось, под влиянием только МК2206 мы не наблюдали образования хвоста у комет, что свидетельствует об отсутствие генотоксичности МК2206. Таким образом, AKT-сигналинг играет важную роль в регуляции репарации доксорубицин-индуцированных повреждений ДНК, включая двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. Учитывая, что ослабление репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках под влиянием ингибитора AKT, может быть связано со снижением эффективности гомологичной рекомбинации ДНР ДНК, мы проанализировали уровень экспрессии очагов γ-H2AX/Rad51 с помощью метода иммунофлюоресцентной микроскопии. Блокирование сигнального пути AКТ нарушает участие белка Rad51 в репарации ДНР ДНК в клетках ОС и внутриклеточного фокального распределения (под влиянием МК2206 не обнаруживалось колокализация γ-H2AX/Rad51). Нокдаун белка Rad51, а также киназы АКТ, в результате трансфекции в клетки остеосарком, соответствующих киРНК (Dharmacon, США) с помощью соответствующих наборов (Amaxa Cell Line Nucleofector KIT T) и нуклеофектора Amaxa 2b (Lonza) показал схожие результаты. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что ингибирование AKT в опухолевых клетках приводит к подавлению Rad51, что может обуславливать снижение эффетивности гомологичной рекомбинации. Для подтверждения способности ингибитора АКТ - МК2206 влиять на эффективность репарации ДНР ДНК путем гомологичной рекомбинации была использована полученная за 1ый год GFP-содержащая клеточная линия остеосаркомы. С помощью проточной цитометрии было выявлено МК2206-индуцированное 2х кратное снижение количества GFP-положительных клеток, что свидетельствует о снижении эффективности репарации ДНР ДНК путем гомологчиной репарации под влиянием MK2206. Также были проведены исследования по выявлению связи между химиочувствительностью и статусом онко-супрессора р53. Полученные результаты свидетельствовали о повышенной гибели клеток U2OS под влиянием комбинации доксорубицина, МК2206 и нутлина-3а (активатора р53) по сравнению с комбинацией доксорубицина и МК2206 и ХП в отдельности. В свою очередь, добавление к комбинации доксорубицина и МК2206 пифитрина (ингибитор р53), повышало выживаемость опухолевых клеток. Таким образом, реактивация р53 усиливает гибель опухолевых клеток под влиянием комбинации доксорубицина и МК2206, а ингибирование белка-онкосупрессора р53 может снижать МК2206-индуцированную гибель опухолевых клеток, обработанных доксорубицином. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности клеток OС и саркомы Юинга к ингибиторам-ДНК-топоизомеразы II типа, например, к доксорубицину; о способности ингибитора АКТ - МК2206 повышать чувствительность опухолевых клеток к доксорубицину за счет снижения эффективности репарации ДНР ДНК, вызванных доксорубицином, путем гомологичной рекомбинации; о прямой связи статуса р53 с химиочувствительностью.

Публикации

1. Бойчук C.В., Галембикова A. Р. ИНГИБИТОР АКТ-СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ПОТЕНЦИРУЕТ ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ДОКСОРУБИЦИНА В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК ОСТЕОСАРКОМ IN VITRO ПОВОЛЖСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК, №3, Том 13, с. 8-20. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.32000/2078-1466-2022-3

2. Галембикова А.Р., Бикиниева Ф.Ф., Копнин П.Б., Бойчук С.В. МЕХАНИЗМЫ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПИРРОЛ-КАРБОКСАМИДОВ В ОТНОШЕНИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ Успехи молекулярной онкологии, - (год публикации - 2023)

3. Бикиниева Ф.Ф., Рахимова Р.М., Михайлов И.С. Механизм резистентности сублинии клеток остеосаркомы U-2 OS с признаками устойчивости к доксорубицину Сборник тезисов 97-й Международной студенческой научно-практической конференции, 29-й Международной научно-практической конференции молодых ученых, 26-й Международной медико-исторической конференции студентов, с. 1179-1180. (год публикации - 2023)

4. Галембикова A. Р., Бойчук C.В. Механизмы резистентности сублинии клеток остеосаркомы Saos-2 с признаками устойчивости к ифосфамиду Успехи молекулярной онкологии, № 4, Том 9, 2022, c.94 (год публикации - 2022)

5. Галембикова А.Р., Бикиниева Ф.Ф., Дунаев П.Д., Мустафин И.Г., Валеева Е.В., Бойчук С.В. Новые подходы к сенситизации сарком мягких тканей и остеосарком к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа Синтез и перспективы использования новых биологически активных терпеноидов: Материалы IV Научно-практической конференции, с. 63-65 (год публикации - 2023)

Возможность практического использования результатов
не указано