КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 21-75-00013

НазваниеИммуносупрессорное действие аденозина в микроокружении опухоли: иммунологическая и эпигенетическая роль аденозин киназы при колоректальном раке

РуководительЖулай Галина Анатольевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Карельский научный центр Российской академии наук", Республика Карелия

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2021 - 06.2023 

Конкурс№60 - Конкурс 2021 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словапротивоопухолевый иммунитет, аденозин киназа, ADK-S, ADK-L, аденозиновый рецептор A2a, регуляторные Т-клетки, цитотоксические CD8+ Т-клетки, иммуносупрессия, метилирование ДНК

Код ГРНТИ34.43.45, 34.43.35

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Внеклеточный аденозин представляет значительный барьер для эффективной иммунотерапии рака и является важной терапевтической мишенью. Активация аденозиновых рецепторов на опухоль-инфильтрирующих клетках и непосредственно на клетках опухоли, приводит к разнообразным реакциям от ингибирования эффекторных лимфоцитов (CD8+ и CD4+ Т-клетки) до стимуляции супрессорных клеток (Tрег и миелоидные супрессоры), тем самым модулируя иммунный ответ и уклоняясь от иммунологического надзора. На сегодняшний день терапевтический потенциал блокады ферментов-эктонуклеотидаз CD39 и CD73, расщепляющих АТФ до аденозина, а также аденозинового рецептора A2a показан в доклинических исследованиях и проверяется на I/II стадиях клинических испытаний для онкологических больных. Эти мишени (CD39, CD73, A2AR) активно исследуются, однако в развитии аденозин-основанного подхода недостаточно хорошо рассмотрено изобилие ферментных путей, управляющих балансом АТФ и аденозина, а также слабо учитывается внутриклеточная регуляция аденозина. Поэтому актуальным является исследование и других компонентов метаболизма аденозина и поиск их связи с иммунными нарушениями в условиях развития опухоли. Особый интерес в этом отношении представляет фермент аденозинозинового пути- аденозин киназа (ADK), представляющая собой две изоформы: короткая ADK-S, обеспечивает рутинное метаболическое удаление аденозина и регулирует его внеклеточный уровень, и длинная ADK-L, с помощью удаления аденозина действует как регулятор метилирования ДНК и гистонов. Роль ADK при развитии опухоли практически не исследована, не исследована связь ADK с иммунологическими показателями. В проекте предлагается определение терапевтической значимости фермента ADK в условиях развития иммунной супрессии у больных КРР. Поскольку в литературе отмечается, что уровень ADK может влиять на уровень внеклеточного аденозина, он может стать перспективной мишенью для регулирования супрессорного микроокружения в опухоли. В этой связи важно анализировать реакцию ключевых для опухоль-ассоциированного иммунного ответа клеточных популяций, которыми являются цитотоксические Т-лимфоциты, специфически уничтожающие опухолевые клетки, и регуляторные Т-лимфоциты, подавляющие специфический ответ. В проекте будут выполнены следующие задачи: -определение связи экспрессии ADK и ee изоформ c экспрессией аденозинового рецептора A2a, с абсолютным и относительным содержанием CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток и Трег-клеток как среди опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов, так и в периферической крови больных КРР, а также с клиническими характеристиками опухоли (степень дифференцировки, инвазии, размер опухоли, стадия TNM). - определение связи ADK c количеством лимфоцитов (CD8+, CD4+ и Трег-клеток ), экспрессирующих эктонуклеотидазы классического пути генерации аденозина (CD39 и СD73). -определение влияния блокады ADK в культуре опухолевых клеток и аутологичных мононуклеарных клеток на функциональную активность эффекторных и супрессорных лимфоцитов. -оценка влияния блокады ADK на эпигенетические изменения при КРР в культуре опухолевых клеток. Предлагаемый проект обладает научной новизной, поскольку в области аденозин-опосредованной иммунной супрессии при развитии рака фермент ADK слабо изучен. В проекте впервые будет проведено исследование экспрессии ADK и его изоформ в связи с опухоль-инфильтрирующими и периферическими лимфоцитами при колоректальном раке (КРР). Впервые будет проведен анализ блокады ADK на функциональную активность ключевых популяций в противоопухолевом иммунном ответе: на эффекторные цитотоксические CD8+ Т-клетки и супрессорные Трег-клетки. Будет создана база для оценки прогностической роли ADK в выживаемости больных КРР. Новизной обладает также оценка эпигенетического влияния ADK на гены-супрессоры опухоли. КРР выбран поскольку является одной из ведущих локализаций среди злокачественных новообразований в общей структуре онкологической заболеваемости в России и в мире (Федоров и Поделякин, 2017). Именно для КРР установлена тесная связь с инфильтрацией опухоли иммунными клетками (Idos et al., 2020). Кроме того, при КРР химиотерапия, оказывающая существенное влияние на клетки, чаще проводится после хирургического удаления опухоли, что при исследовании операционного материала позволяет оценить механизмы системного и локального иммунного ответа без влияния препаратов.

Ожидаемые результаты
Будут получены новые сведения об одном из механизмов элиминации супрессорного аденозина в микроокружении опухоли. Предполагается установить роль аденозин киназы в иммунном ответе, формирующемся при КРР, в частности в изменении содержания и функциональной активности таких ключевых для противоопухолевого иммунного ответа популяций лимфоцитов как цитотоксические CD8+ Т-клетки и супрессорные Трег-клетки. Ожидается определение связи уровня ADK (как регулятор внеклеточного аденозина) и A2AR (как показатель воздействия аденозина), а также связи с степенью участия исследуемых лимфоцитов в генерации аденозина по экспрессии ими классических эктонуклеотидаз CD39 и CD73. Будет получена база для дальнейшей оценки прогностической значимости ADK и A2AR для выживаемости больных КРР. Особый акцент будет сделан на эпигенетической роли аденозинового пути: впервые будут получены сведения об изменении уровня ADK и степени метилирования промоторов генов-супрессоров опухоли и функциональной активности супрессорной популяции Трег-клеток по уровню метилирования региона TSDR гена FOXP3. Ожидаемые результаты обладают непосредственной значимостью. Предполагается установить терапевтическую роль ADK и/или его изоформ. Поиск и выявление критериев системы регуляции уровня аденозина и ответа иммунной системы в микроокружении опухоли позволит повысить эффективность выбора персонализированного лечения. Данное исследование представляет собой перспективное направление, поскольку в настоящее время аденозиновый путь активно исследуется в отношении мишени для противоопухолевой терапии. Принимая во внимание распространенность онкологических и воспалительных заболеваний, а также внедрение клеточных технологий в их терапию, ожидается, что полученные результаты будут иметь существенную практическую значимость, поскольку смогут экспериментально доказать важность изучения влияния опухоли на функционирование лимфоцитов.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Аденозин киназа (ADK) является важным ферментом для поддержания клеточного метаболизма поскольку регулирует внутриклеточный и внеклеточный уровни аденозина, фосфорилируя его в 5’-аденозин монофосфат. ADK имеет 2 изоформы: локализующуюся в ядре длинную (ADK-L) и цитоплазматическую короткую (ADK-S). В настоящее время предполагается, что эти изоформы могут играть разное значение: если ADK-S отвечает в основном за рутинное удаление аденозина, то ADK-L может регулировать реакции метилирования, в том числе и ДНК. Внеклеточный аденозин оказывает иммуносупрессорное действие и является мишенью для лечения рака. В связи с этим исследование аденозин-конвертирующих ферментов может иметь терапевтическое значение. В проекте на первом этапе была проанализирована экспрессия ADK и транскриптов его изоформ ADK-L и ADK-S в периферической крови и ткани кишечника больных колоректальным раком (КРР). Обнаруженные результаты свидетельствуют о возможном участии ADK в патогенезе заболевания. Показано, что уровень экспрессии мРНК ADK не одинаково изменяется на периферии, где он был ниже контроля, и в опухоли, где он был выше контроля. Кроме того, обнаружена прямая связь между уровнем мРНК ADK-S и числом Treg-клеток, экспрессирующих на своей поверхности эктонуклеотидазу CD39. Показано повышенное содержание отдельных клеточных популяций среди эффекторных клеток (CD8+ и CD4+) и супрессорных Т-клеток (Treg), указывающих на формирование иммунной супрессии у больных КРР как на периферии, так и в опухолевой ткани. Полученные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего исследования связи ADK с аденозин-опосредованной иммунной супрессии при развитии КРР.

 

Публикации

1. Жулай Г., Олейник К., Шибаев М., Игнатьев К. Adenosine-Metabolizing Enzymes, Adenosine Kinase and Adenosine Deaminase, in Cancer Biomolecules, 12(3), 418 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/biom12030418

2. Жулай Г.А., Шибаев М.И., Игнатьев К.С Изменение экспрессии гена, кодирующего фермент аденозин киназу, при колоректальном раке Сборник тезисов 25-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА», Пущино: ФИЦ ПНЦБИ РАН, 2022. С 306 (год публикации - 2022)

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В биологии опухоли малоизученным остается фермент аденозинкиназа (ADK), который регулирует внутри- и внеклеточный уровни аденозина (ADO) посредством его фосфорилирования в 5’-аденозинмонофорсат, используя 5’-аденозинтрифосфат как донора фосфатных групп. ADK имеет 2 изоформы: локализующуюся в ядре длинную (ADK-L) и цитоплазматическую короткую (ADK-S). ADK-L участвует в реакции SAM-зависимого трансметилирования, которое запускает ДНК и гистонное метилирование. Роль ADK-L в качестве регулятора трансметилирования была обнаружена в экспериментальной модели эпилепсии (Williams-Karnesky et al., 2013). Позднее показана связь экспрессии ADK-L и глобального метилирования ДНК в клетках HeLa. Ингибиторы ADK значительно уменьшали глобальное метилирование ДНК в клетках HeLa в зависимости от их концентрации (Wahba 2021). Значительные изменения в паттернах метилирования ДНК являются патологическим признаком многих видов рака. На втором этапе проекта оценивали связь уровня мРНК изоформы ADK-L со степенью метилирования генов, связанных с развитием КРР, SEPT9, APC и FOXP3-TSDR в образцах опухолевой и нормальной ткани кишки больных КРР. Методом MS-HRM показано изменение уровня метилирования анализируемых генов в образцах опухолевой ткани. Однако достоверной корреляционной связи между уровнем мРНК ADK-L и степенью метилирования генов SEPT9, APC и FOXP3-TSDR у больных КРР не выявлено. Во второй части проекта также было проанализировано функционирование лимфоцитов CD8+ и Treg-клеток в экспериментальных условиях, приближенных к микроокружению опухоли, в присутствии рекомбинантной ADK. Полученные результаты свидетельствуют о том, что rADK может усиливать экспрессию эктонуклеотидазы CD73 на CD8+ и CD4+ Т-клетках больных КРР. А также способствовать накоплению CTLA-4+Treg-клеток при со-культивировании Т-клеток и клеток колоректального рака (Caco-2 и SW837), вероятно посредством ADK-S.

 

Публикации

1. Жулай Г.А., Шибаев М.И. Связь экспрессии изоформ аденозинкиназы и эктонуклеотидаз CD39/CD73 в крови больных колоректальным раком Acta Naturae, № 2(57), Т. 15 (год публикации - 2023)

2. Жулай Г.А., Шибаев М.И. Экспрессия изоформ ADK-S и ADK-L и их связь с CD39/CD73/A2аR при колоректальном раке Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2023)

3. Жулай Г.А., Васильева А.В., Шибаев М.И., Аторин Д.А. Исследование связи экспрессии гена аденозинкиназы с экспрессией CD39 и СD73 при колоректальном раке Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 76-й Всероссийской школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 11–14 апреля 2023 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского., С. 118 (год публикации - 2023)

Возможность практического использования результатов
Полученные в результате реализации проекта данные являются новыми и свидетельствуют о возможном влиянии ADK на работу эффекторных Т-клеток и супрессорных Treg-клеток при КРР, что можно использовать для модуляции иммунного ответа. Кроме того, открывается перспектива исследования связи CD73 и ADK-L, поскольку CD73 в настоящее время рассматривается как молекула иммунной контрольной точки.